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Jul 18, 2023

Wasserstoff und dunkler Sauerstoff fördern die mikrobielle Produktivität in verschiedenen Grundwasserökosystemen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3194 (2023) Diesen Artikel zitieren 8559 Zugriffe 3 Zitationen 154 Altmetric Metrics Details Rund 50 % der Menschheit sind auf Grundwasser als Quelle angewiesen

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154 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Rund 50 % der Menschheit sind auf Grundwasser als Trinkwasserquelle angewiesen. Hier untersuchen wir das Alter, die Geochemie und die Mikrobiologie von 138 Grundwasserproben aus 95 Überwachungsbrunnen (<250 m Tiefe), die sich in 14 Grundwasserleitern in Kanada befinden. Die Geochemie und Mikrobiologie zeigen konsistente Trends, die auf groß angelegte aerobe und anaerobe Wasserstoff-, Methan-, Stickstoff- und Schwefelkreisläufe hinweisen, die von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften durchgeführt werden. Ältere Grundwässer, insbesondere in Grundwasserleitern mit organischen kohlenstoffreichen Schichten, enthalten im Durchschnitt mehr Zellen (bis zu 1,4 × 107 mL−1) als jüngere Grundwässer, was aktuelle Schätzungen der Zellhäufigkeit unter der Oberfläche in Frage stellt. Wir beobachten erhebliche Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff (0,52 ± 0,12 mg L−1 [Mittelwert ± SE]; n = 57) in älteren Grundwässern, die den aeroben Stoffwechsel in unterirdischen Ökosystemen in einem beispiellosen Ausmaß zu unterstützen scheinen. Metagenomik, Sauerstoffisotopenanalysen und Mischungsmodelle weisen darauf hin, dass dunkler Sauerstoff in situ durch mikrobielle Dismutation erzeugt wird. Wir zeigen, dass altes Grundwasser produktive Gemeinschaften ernährt und eine übersehene Sauerstoffquelle in gegenwärtigen und früheren unterirdischen Ökosystemen der Erde hervorhebt.

Etwa 2 % der Wasserressourcen der Erde liegen als Grundwasser vor, davon ist die Hälfte salzhaltig und die andere Hälfte Süßwasser1. Dieses unterirdische Süßwasser stellt rund 30 % der weltweiten Süßwasserressourcen dar, sechzigmal mehr als in allen Seen, Flüssen und der Atmosphäre zusammen und wird nur von den unzugänglichen und derzeit noch gefrorenen Polkappen übertroffen1. Grundwasserleiter und Gesteinsbrüche können auch bis zu 30 % der gesamten mikrobiellen Biomasse auf der Erde enthalten2,3, wesentlich zur Kohlenstofffixierung beitragen4 und hohe Anteile unkultivierter Archaeen, Bakterien und Viren2,5 mit einem breiten Spektrum an Lebensstilen enthalten6. Trotz des weltweiten Vorkommens von Grundwasser und der Größe und Vielfalt seiner Biomasse ist unser Verständnis der Zusammensetzung und Aktivität der mikrobiellen Gemeinschaften, die diese verborgenen aquatischen Ökosysteme bewohnen, immer noch lückenhaft und basiert oft auf Proben einiger weniger ausgewählter Brunnen oder eines einzelnen Grundwasserleiters. Insbesondere die geochemischen und ökologischen Prozesse, die die mikrobiellen Gemeinschaften im Grundwasser über Raum und Zeit formen, sind nicht gut begrenzt7.

Um robuste Verbindungen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften und geochemischen Eigenschaften von Grundwasser herzustellen, sind große Datensätze mit einem umfassenden Umweltinventar erforderlich, das jeder Probe mikrobieller Gemeinschaften zugeordnet ist. Zu diesem Zweck hat das von Alberta Environment and Protected Areas (AEPA) in Kanada betriebene Groundwater Observation Well Network (GOWN) geochemische Daten für über 250 Grundwässer zusammengestellt, die aus Überwachungsbrunnen in verschiedenen Grundwasserleitern und geografischen Regionen gewonnen wurden und eine Vielzahl geochemischer Regime repräsentieren und Grundwasseralter. Von jeder GOWN-Quelle wurden über viele Jahre hinweg wiederholt Proben genommen, einige sogar über mehrere Jahrzehnte hinweg8. Seit 2006 werden im Rahmen dieses umfassenden Überwachungsprogramms systematisch regelmäßig Informationen zum Wasserstand und zur chemischen Wasserqualität sowie Isotopenzusammensetzungen für wässrige und gasförmige Proben gesammelt9. Die Provinz Alberta liegt im westkanadischen Sedimentbecken, das große Öl-, Gas-, Kohle- sowie Schwefel-, Salz-, Kalkstein- und Dolomitvorkommen beherbergt10. Der flache und tiefe Untergrund wurde im Zusammenhang mit der Erdöl- und Kohleexploration und -entwicklung eingehend untersucht11 (Abb. 1).

a Standort der untersuchten Grundwasserbrunnen im Energieressourcenkontext der Provinz Alberta. Farben zeigen das Grundwasseralter an jedem Brunnen an (gelb: jüngeres Wasser; rot: mittleres Alter; blau: älteres Wasser, das sulfatreich ist; lila: älteres Wasser mit wenig Sulfat). Die Kreisgröße stellt die durchschnittliche Anzahl mikrobieller Zellen in den Grundwasserproben dar und reicht von 104 (kleinster Vollkreis) bis 107 Zellen pro ml (größter Kreis). Die Karte wurde mit Arc-GIS v10.8 erstellt. b Relativer Anteil der Wassertypen in den Oberflächen-, Kanal- und Grundgesteinssedimenten sowie in den wichtigsten geologischen Formationen von Alberta, was zeigt, dass sich die Grundwassergeochemie mit zunehmendem Alter der Formationen weiterentwickelte. NA nicht bewertet, HSC Horseshoe Canyon, Gp. Gruppe.

In dieser Arbeit analysierten wir 138 Grundwasser aus 95 GOWN-Brunnen, die in Grundgestein und Oberflächengrundwasserleitern in ganz Alberta durchgeführt wurden (Abb. 1, Tabelle S1, Zusatzdaten 1), mit dem Ziel, die Biogeochemie und mikrobielle Ökologie eines breiten Spektrums von Grundwasserleiterumgebungen zu untersuchen. Wir verwendeten eine multidisziplinäre Charakterisierung der geochemischen Zusammensetzung des Grundwassers, einschließlich Haupt- und Nebenionenkonzentrationen, gelöster Gase, Bestimmung des Grundwasseralters sowie der Zusammensetzungen und Stoffwechselfähigkeiten seiner ansässigen mikrobiellen Gemeinschaften. Die Leitziele bestanden darin, (i) zu bestimmen, ob die Geochemie mit der Zusammensetzung und dem Stoffwechsel der Mikrobengemeinschaften übereinstimmt, (ii) welche Elektronendonoren und -akzeptoren diese Gemeinschaften unterstützen und (iii) welche mikrobiellen Abstammungslinien Schlüsselpopulationen darstellen. Wir zeigen, dass alte Grundwässer produktive und vielfältige mikrobielle Gemeinschaften beherbergen können. Metagenomanalysen und Geochemie zeigen, dass diese Gemeinschaften ihren Lebensunterhalt mit Wasserstoff, Methan, Schwefel und molekularem Sauerstoff verdienen. Wir zeigen, dass molekularer Sauerstoff wahrscheinlich vor Ort produziert wurde und eine Rolle in der Biogeochemie und Ökologie dieser unterirdischen Ökosysteme spielt.

Die mittlere Verweilzeit von Wasser in einem Grundwasserleiter ist ein sehr wichtiger Faktor, der dessen geochemische Zusammensetzung (oder Fazies) beeinflusst (Abb. 2a). Die mittlere Verweilzeit oder das Grundwasseralter wird anhand von Radioisotopen wie Tritium und 14C bestimmt und bezieht sich auf die Reisezeit zwischen dem Ort der Infiltration und dem Ort der Probenahme12. In dieser Studie korrelierte das Grundwasseralter umgekehrt mit dem Verhältnis zwischen Kalzium- und Natriumkonzentrationen im Grundwasser (Abb. 2b). Die jüngsten, tritiumhaltigen Grundwässer (was auf eine Neubildung nach 1952 hindeutet) zeichneten sich durch niedrige Gesamtgehalte an gelösten Feststoffen (<400 mg L−1) und hohe Ca/Na-Verhältnisse (Median: 3,5) aus. Die Auflösung von Karbonaten während der Infiltration führte zu hohen Kalzium-, Magnesium- und Bikarbonatkonzentrationen in diesen Gewässern. Diese jungen Grundwässer (gelbe Symbole, Abb. 2) hatten im Allgemeinen niedrige Methan- und Sulfatkonzentrationen (Abb. 3a, b) und wurden überwiegend aus Bohrlöchern gesammelt, die in oberflächlichen neogen-quartären Ablagerungen fertiggestellt wurden (Abb. 1b).

ein Piper-Diagramm der hydrochemischen Fazies jeder Grundwasserprobe (Kreise), das das Calcium/Natrium-Massenverhältnis visualisiert und als Proxy für die geochemische Entwicklung, d. h. Verweilzeit/Alter, verwendet wird. Na: Natrium, K: Kalium, Ca: Calcium, Mg: Magnesium, Cl−: Chlorid, SO42−: Sulfat, CO32−: Carbonat, HCO3−: Bicarbonat b Ca/Na-Verhältnis nimmt mit zunehmender Verweilzeit ab (14CDIC unkorrigiertes Alter, BP: vor der Gegenwart). 14C: 14Kohlenstoff, DIC: gelöster anorganischer Kohlenstoff. Proben, die sich etwa 40.000 Jahre vor Christus (Nachweisgrenze der Methode) in der Parzelle ansammeln, können viel älter sein. 3H-positive Proben (Kreise mit Kreuzen) umfassen Meteorwasser aus der Zeit nach 1952 (H-Bombe) und bestätigen den Alterstrend. c Schematische Zeitleiste und Zusammenfassung der Wasseralterung.

Mikroben, die den Kreislauf von Methan (CH4) und Sulfat (SO42−) vermitteln, wirken sich auf die Kohlenstoff- und Schwefelspeicher in den Grundwassersystemen aus. Jeder Kreis stellt eine Probe dar. Die Kreisfarbe zeigt das Wasseralter an. Trends hinsichtlich der Reduktion und Oxidation der Verbindungen werden durch Pfeile oder Flächen angezeigt. a Kohlenstoffisotopensignatur von Methan im Vergleich zur Methankonzentration. PDB Pee Dee Belemnite. b Schwefelisotopensignatur von Sulfat im Vergleich zur Sulfatkonzentration. V-CDT Vienna-Canyon Diablo Troilite c Kohlenstoffisotopensignatur von Kohlendioxid im Vergleich zur Kohlenstoffisotopensignatur von Methan. ε Fraktionierung CO2-CH4. AC/MR Aceticlastic-/methylotrophe Methanogenese. d Schwefelisotopensignatur von Sulfat im Vergleich zur Sauerstoffisotopensignatur von Sulfat.

Im Gegensatz dazu enthielten die ältesten Grundwässer (violette Symbole, Abb. 2) kein Tritium und wenig 14C, was auf Grundwässer hinweist, die älter als mehrere hundert oder tausend Jahre sind. Sie hatten einen erhöhten Gesamtgehalt an gelösten Feststoffen (>900 mg L−1) und ein niedriges Ca/Na-Verhältnis (Median: 0,01). Alte Grundwässer waren durch reduzierende Bedingungen gekennzeichnet und enthielten hohe Konzentrationen an gelöstem Methan (12,8 ± 2,4 mg L−1 [Mittelwert ± SE]; Median: 0,72 mg L−1, Bereich: 0,001–74,2 mg L−1; Abb. 3a, Ergänzung Daten 1). Diese Gewässer wiesen erhöhte Natrium-, Bikarbonat- und Chloridkonzentrationen auf, die auf Wechselwirkungen zwischen Wasser und Gestein, einschließlich Ionenaustausch, und Verwitterung von Mineralien zurückzuführen waren. Die älteren Grundwasserproben wurden aus Brunnen entnommen, die in vergrabenen Flusstälern (Kanälen) und in sedimentären Grundgesteinsformationen aus dem Paläogen und der Kreidezeit angelegt wurden, die häufig durch das Vorhandensein von Kohle und/oder Schiefer gekennzeichnet sind13.

Sulfat, das vorwiegend aus der Oxidation von Pyrit und in geringerem Maße aus der Auflösung von Anhydrit oder Gips stammt14, war in einer dritten Gruppe von Grundwasserproben allgegenwärtig (blaue Symbole, Abb. 2). Diese Wässer zeichneten sich durch lange Verweilzeiten aus, enthielten noch mehr gelöste Feststoffe (>1700 mg L−1) und hatten mittlere Ca/Na-Verhältnisse (Median von 0,12). Sulfat war oft der am häufigsten vorkommende Anionen- und Elektronenakzeptor in dieser Gruppe von Grundwässern, was zu sulfatreichen hydrochemischen Fazies mit niedrigen Methankonzentrationen führte. Diese Grundwasserproben wurden aus Bohrlöchern in oberflächlichen Lagerstätten, aber auch aus Grundgesteinsgrundwasserleitern in klastischen, oft marinen Sedimentgesteinen der Bearpaw-Formation entnommen (Abb. 1b).

Durch die Vermischung von Grundwasser unterschiedlichen Alters und geochemischer Wassertypen (Abb. 2a) entstehen häufig charakteristische intermediäre hydrochemische Fazies (rote Symbole, Abb. 2). Diese Wässer wurden größtenteils aus Grundwasserleitern in Oberflächenablagerungen und gelegentlich aus Grundgesteinsgrundwasserleitern gewonnen (Abb. 1b). Eine detaillierte Charakterisierung der geologischen Formationen, der Grundwassergeochemie und des Alters finden Sie in den Ergänzenden Ergebnissen und Ergänzenden Daten 1.

Die mikrobielle Zelldichte nimmt in marinen15 und terrestrischen3 Untergrundökosystemen häufig mit zunehmender Tiefe ab. Dieser Rückgang der Zellzahl und Biomasse wird häufig auf die Energiebegrenzung in unterirdischen Ökosystemen zurückgeführt16. Innerhalb von Grundwasserleitern nimmt die Zellzahl nicht unbedingt mit zunehmender Tiefe ab17, sondern ist auf andere Faktoren zurückzuführen, darunter das zunehmende Wasseralter18,19. Zu unserer Überraschung fanden wir in Grundwasserleitern mit altem Grundwasser deutlich mehr Zellen als in solchen mit jüngerem Wasser (Abb. 4, Zusatzdaten 2). Dies deutet darauf hin, dass es sich bei den älteren Grundwasserleitern und geochemisch entstandenen Grundwässern tatsächlich um produktive Ökosysteme handelt, die Energie für das Wachstum von Mikroorganismen liefern. Die durchschnittliche Zellzahl in den geochemisch entstandenen Grundwasserproben erreichte 107 Zellen mL−1 (Abb. 4). Insgesamt nahm die Anzahl mikrobieller Zellen in der gesamten untersuchten Region nicht mit der Tiefe ab (ergänzende Abbildung 2a, b). Die Zellzahlen waren in Grundwasserleitern in geologischen Schichten, die Schiefer oder Kohle enthielten, im Durchschnitt etwas höher (ergänzende Abbildung 2c), was darauf hindeutet, dass erhöhte Gehalte an organischem Kohlenstoff Mikroben zusätzliche Energiequellen bieten könnten. Es ist zu beachten, dass es sich bei den hier dargestellten Zellzahlen um konservative Schätzungen handelt, die wahrscheinlich nur die frei lebenden Zellen aus Wasserproben erfassen, was die beträchtliche Anzahl der in Biofilmen lebenden Zellen nicht erklären kann20.

Die Zellhäufigkeit wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt und ist im logarithmischen Maßstab angegeben. Boxplots zeigen das 1. und 3. Quartil, Maximal- und Minimalwerte (Whisker), Median (Linie), Mittelwert (Dreieck) und Ausreißer (Punkte). a Boxplots stellen Grundwasserproben aus einzelnen Brunnen dar und fassen die Zellzahlen aus n unabhängigen Sichtfeldern zusammen. n = 40: Proben 3–10, 12, 15–22, 24–29, 34–47, 49–51, 54, 56, 63, 67–68, 70–71. n = 39: Proben 1, 14, 33. n = 38: Proben 2. n = 20: Proben 13, 31–32, 55, 57, 61, 72. n = 12: Proben 73. Weitere Details zu einzelnen Zellen Zählungen siehe Zusatzdaten 2. X-Achse: Die Zahlen entsprechen den Well-IDs (aus Platzgründen sind die Well-IDs in den Zusatzdaten 1 angegeben). Wells, die zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten beprobt wurden, sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet, technische Replikate sind mit einem Plus (+) gekennzeichnet. b Boxplots stellen die über das Grundwasseralter gemittelten Zellzahlen dar und fassen die durchschnittlichen Zellzahlen in a zusammen (ohne technische Replikate). n Anzahl der Proben. Die Signifikanz wurde mithilfe eines Wilcoxon-Rangsummentests getestet. Signifikanzniveaus sind: *p ​​< 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; (unkorrigiert).

Die Morphologie und Größe der Zellen variierte stark und umfasste kokken-, stäbchen-, vibrio- und spiralförmige Zellen sowie Filamente und kleine Aggregate (ergänzende Abbildung 3). Zellmorphologien, scharfe Zellgrenzen und das helle Signal der Nukleinsäurefärbung ließen auf eine weitgehend aktive Gemeinschaft schließen21. Die durchschnittliche Zellgröße war in allen Grundwasserproben ähnlich und daher sind hohe Zellzahlen ein Indikator für eine hohe Biomasse und Produktivität (ergänzende Abbildung 3). Nach unserem besten Wissen ist dies das erste Mal, dass in alten Grundwasserleitern in einem großen geografischen Gebiet (>210.000 km2) konstant hohe Zellhäufigkeiten dokumentiert wurden.

Der Anstieg der Zellzahlen mit dem Grundwasseralter ging mit einem erheblichen Rückgang der archaischen und bakteriellen Vielfalt einher (Abb. 5a, b; ergänzende Abb. 4) und einer Verschiebung der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur von jungen zu alten Grundwässern (Abb. 5c, d; Ergänzende Abbildung 5). Von den von uns getesteten Umweltparametern waren Methankonzentrationen und geochemische Proxies für das Grundwasseralter, einschließlich der Konzentrationen von Natrium, Kalzium und Magnesium sowie der Bohrlochtiefe, diejenigen, die die Varianz in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur am stärksten erklärten (Abb. 5e, f). . Ein Rückgang der Vielfalt und Veränderungen in der Gemeinschaftsstruktur sind häufige Merkmale mikrobieller Blütesituationen in produktiven Ökosystemen, die häufig eine erhöhte Häufigkeit einiger weniger Schlüsselarten aufweisen22,23.

a Archaeal- und b bakterielle Alpha-Diversitätsindizes der untersuchten Grundwässer basierend auf 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzvarianten (ASVs). Die Signifikanz wurde mithilfe eines Wilcoxon-Rangsummentests getestet. Signifikanzniveaus: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; (unkorrigiert). Archaeen-c- und bakterielle-d-Gemeinschaftsstruktur, dargestellt als nichtmetrische mehrdimensionale Ordinationen basierend auf Gemeinschaftsabständen. Stichproben (Kreise) werden mit dem durchschnittlichen gewichteten Mittelwert der Abstände innerhalb der Gruppe verbunden (Schwerpunkt; Ellipsen zeigen eine Standardabweichung). n: siehe a bzw. b. Redundanzanalyse (RDA) der e-Archaeen- (n = 64) und f-Bakteriengemeinschaftsstruktur (n = 110) in Grundwasserproben (Kreise) unter Verwendung ausgewählter Parameter (Pfeile). Signifikanzniveaus: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; (unkorrigiert). Das vollständige Modell war für beide Domänen von hoher Bedeutung, und zusammen erklärten die 11 Parameter 11 % der archaealen und 18 % der bakteriellen Variation. Die Farblegende in c gilt für alle Panels. CO2 Kohlendioxid, DIC gelöster anorganischer Kohlenstoff.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass Wasserstoff eine wichtige Energiequelle für die hohe Produktivität in reifem Grundwasser ist. An ausgewählten Stellen wurden beträchtliche Mengen an gelöstem Wasserstoff nachgewiesen (0,002, 0,007 und 0,1 % in den Proben GW121, GW223 und GW951), und in vielen Grundwasserleitern zeigten mit Methanobacterium, Methanoregula und Methanospirillum assoziierte hydrotrophe Methanogene eine hohe relative Häufigkeit des 16S-rRNA-Gens Amplikonsequenzvarianten (ASVs; Abb. 6a, Ergänzende Abb. 6, 7, Ergänzende Daten 3). Wasserstoff dient als einziger Elektronendonor für diese Abstammungslinien und die Isotopenzusammensetzung von CH4 und CO2 unterstützt auch eine weit verbreitete hydrotrophe Methanogenese (Abb. 3c). In allen analysierten Grundwasserproben war Methan in Konzentrationen von 0,006 bis über 74 mg L−1 vorhanden (Abb. 3a). Die meisten Proben wiesen jedoch Konzentrationen <1 mg L−1 auf (73 %; n = 106, ergänzende Abbildung 6). Basierend auf der kombinierten Kohlenstoff- und Wasserstoffisotopenzusammensetzung spiegeln die niedrigen Methankonzentrationen wahrscheinlich einen hohen relativen Verbrauch durch mikrobielle Methanoxidationsmittel wider (Abb. 3a).

Relative Sequenzhäufigkeit der 20 häufigsten a-archaealen und b,c-Bakterienlinien auf Gattungsebene basierend auf 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzvarianten. Die verbleibenden Abstammungslinien mit geringerer Häufigkeit werden als „Andere“ zusammengefasst. Gattungen, die in der SILVA-Referenzdatenbank nicht klassifiziert wurden, werden mit unc abgekürzt und die nächsthöhere phylogenetische Ebene wird angezeigt. Die beiden mit * gekennzeichneten archaischen Gruppen gehören zur Ordnung der Woesearchaeales. Ein Methanogen sowie fast die Hälfte (9 von 20) der wichtigsten Bakteriengattungen werden ebenfalls durch durch Metagenome zusammengesetzte Genome repräsentiert (Abb. 7). Die Legende in b gilt für alle Panels.

Zu den nachgewiesenen Methanoxidationsmitteln gehörten obligat anaerobe Methanoxidierende Archaeen (ANME) der Gattung Methanoperedens (ANME-2d, Abb. 6a). Diese Methanotrophen wurden häufig in Grundwasserleitern gefunden, die entweder gelöstes Eisen oder Mangan oder beides enthielten. ANME-2d wurden in mehr als der Hälfte der archaischen ASV-Datensätze (34 von 64) gefunden, überwiegend in methanreichen und sulfatarmen älteren Grundwässern, was mit ihrem zuvor beobachteten Vorkommen in tiefen Granitwasserumgebungen übereinstimmt24. Ihre Fähigkeit, Methan mithilfe von Eisen- und Manganoxiden zu oxidieren, könnte die hohe relative ASV-Häufigkeit von über 40 % im sulfatarmen, reifen Grundwasser von mindestens vier Proben (GW111, GW218, GW311 und GW456) erklären. Methanoperedens war die fünfthäufigste Archaeengattung in den untersuchten Grundwasserleitern und verfügt über das Stoffwechselpotenzial, die Kohlenstoff-, Stickstoff- und Metallkreisläufe über die anaerobe Oxidation von Methan zu verbinden26,27. In bestimmten Grundwasserleitern könnte es auch zu einer anaeroben Oxidation von Methan in Verbindung mit einer bakteriellen Sulfatreduktion kommen, da ANME-2ab bei GW160 fast die Hälfte der Archaeengemeinschaft ausmachte und ANME-2c bei GW220 nachgewiesen wurde (Supplementary Data 3). Bakterielle Methanomirabiliales, eine Ordnung, von der bekannt ist, dass sie Mikroben umfasst, die in anoxischen Umgebungen Methan mithilfe von Nitrit oxidieren können, waren in vielen Grundwasserleiterdatensätzen reichlich vorhanden, insbesondere in jungen und mittelschweren Gewässern (ergänzende Abbildung 8).

Wasserstoff könnte auch das Wachstum von Organismen der Gattungen Desulforudis und Desulfomicrobium sowie vieler anderer Sulfat- und Schwefelreduzierer und Schwefeldisproportionierer aufrechterhalten haben, die in den untersuchten Grundwasserökosystemen vielfältig und weit verbreitet waren (Abb. 6b, ergänzende Abb. 9, ergänzende Daten). 4). Candidatus Desulforudis audaxviator waren in allen ASV-Datensätzen die am häufigsten vorkommenden Sulfatreduzierer, kamen jedoch überwiegend in alten Grundwässern vor. Sie machten oft mehr als 50 % der Kladen aus, von denen bekannt ist, dass sie schwefelcyclisierende Mikroben enthalten. Ca. Desulforudis sind wasserstoffoxidierende und sulfatreduzierende Clostridien, die Berichten zufolge in Ökosystemen tiefer terrestrischer Grundwasserleiter gedeihen29. In den Proben GW3026 und GW217 fanden wir eine hohe Sequenzhäufigkeit von Mikroben, die mit obligat syntrophischen Smithella sp. assoziiert sind. und Syntrophus sp. die mit Organismen zusammenleben, die Wasserstoff absorbieren30,31.

Die Shotgun-Metagenomik stützte die aus der Amplikonsequenzierung abgeleiteten Schlussfolgerungen und enthüllte Gene, die für Ni-Fe-Hydrogenasen, hydrotrophe Methanogenese und Sulfatreduktion in den Grundwassergemeinschaften kodieren (Abb. 7). Ein hochwertiges Metagenom-assembliertes Genom (MAG) einer Population innerhalb der Methanobacteriaceae (UBA349, MAG-32) enthielt eine vollständige Methyl-Coenzym-M-Reduktase (mcrABCG) und alle anderen Gene, die für die hydrotrophe Methanogenese benötigt werden (cdhA-E, ftr, mch, fae), es fehlten jedoch diagnostische Gene für die methylotrophe oder aceticlastische Methanogenese (Supplementary Data 5). Ein vollständiger Sulfatreduktionsweg wurde in MAG-18 gefunden, einem Organismus in der Klasse UBA2262 auf Gattungsebene innerhalb der Desulfovibrionaceae (Abb. 7). Der Wasserstoff könnte aus mikrobieller Fermentation stammen, z. B. über Fe-Fe-Hydrogenasen, die in drei mit Bacteroidia verbundenen MAGs vorhanden waren (Lutibacter, UBA6024, JAAYJT01; Supplementary Data 5). Diese MAGs kodierten auch das TonB/SusC-Transportsystem, das viele Bacteroidia zum Konsum von Oligosacchariden nutzen. Wasserstoff kann auch aus abiotischen Quellen stammen, darunter Schiefer, Kohleflöze und andere Schichten mit hohem Gehalt an organischen Stoffen32, Wasser-Gesteins-Reaktionen33, Pumpausrüstung oder Stahlbrunnengehäuse34 oder sogar Wasserradiolyse35,36.

Ausgewählte metagenomassemblierte Genome (MAGs) reichlich vorhandener mikrobieller Populationen im Grundwasser zeigen die genetischen Fähigkeiten des Methan-, Schwefel- und Stickstoffkreislaufs. Die Farbschattierung stellt die Vollständigkeit des Signalwegs dar, die enthaltenen Gene sind in Klammern angegeben. Zahlen beziehen sich auf die Redundanz in einem Signalweg oder Enzym. Beispielsweise verfügt MAG-06 über zwei Methanmonooxygenasen, eine kodiert durch pmoABC, die andere durch smmo und mmoDYZ. Kommas zwischen Genen: und; Bindestriche zwischen Genen: und/oder. Die MAG-Taxonomie basiert auf GTDB-Tk und die Häufigkeit wurde durch Lesekartierung unter Berücksichtigung von gruppierten und nicht gruppierten Lesevorgängen geschätzt. Der vollständige Satz von 61 aus Metagenomen zusammengesetzten Genomen und 450 annotierten Genen ist in Supplementary Data 5 enthalten.

Wir fanden in den meisten alten Grundwässern, die aus begrenzten Grundwasserleitern stammen, eine hohe relative ASV-Häufigkeit von Mikroben, die mit obligaten und fakultativ aeroben wasserstoff-, methan- und schwefeloxidierenden Linien assoziiert sind (Abb. 6, 8, ergänzende Abb. 7–10, ergänzende). Daten 4). Das Vorhandensein potenziell aerober Organismen war nicht auf Probenhandhabung, Kontamination oder mikrobielles Wachstum nach der Probenahme zurückzuführen, und die Alpha- und Beta-Diversität, Zusammensetzung und Zellzahl änderten sich nicht mit der Probenlagerzeit (ergänzende Abbildung 11, Methoden). Daher sind wir zuversichtlich, dass diese Mikroben zum Zeitpunkt der Probenahme in den Grundwasserleitern vorhanden waren. Analysen von Metagenomen aus fünf Brunnen (GW114, GW144, GW218, GW265 und GW972, alle mit altem Grundwasser) bestätigten die über Metabarcoding ermittelte Zusammensetzung der Gemeinschaft. Kartierte metagenomische 16S-rRNA-Gen-Kurzablesungen (ergänzende Abbildung 12) sowie rekonstruierte 16S-rRNA-Gensequenzen in voller Länge (ergänzende Daten 6) zeigten dieselben Schlüsselgattungen und häufig dieselben Arten wie die ASV-Datensätze. Die Zuverlässigkeit der ASV-basierten Community-Zusammensetzung wurde außerdem durch sehr hohe Sequenzähnlichkeiten zwischen ASVs und rekonstruierten 16S-rRNA-Genen voller Länge gestützt (Ergänzende Abbildung 13, Ergänzende Daten 7). Beide Sequenzierungsansätze zeigen die gleichen Hauptakteure, darunter Methylobacter tundripaludum (MAG-01 – 04), Methylotenera sp. (MAG-09 – 13), Hydrogenophaga sp. (MAG-14 – 17), Sulfuricurvum sp. (MAG-19) und Thiobacillus sp. (MAG-20; Abb. 7).

a Hydrogenophaga, b Methylobacter und Methylotenera und c Sulfuricurvum und Thiobacillus. Die Sauerstoffkonzentration wird auf einer Pseudo-Log10-Skala angezeigt, um Proben ohne Sauerstoff (Null) einzuschließen. Boxplots fassen die relative Häufigkeit von d-Hydrogenotrophen, e-Methylotrophen, f-Thiotrophen und g-Sauerstoffkonzentrationen basierend auf Wasseralterkategorien zusammen (obere und untere Quartile und Whisker (jeweils 25 % der Daten darstellen), Median (Linie) und Ausreißer (Punkte)). . Die relativen Sequenzhäufigkeiten der aeroben/denitrifizierenden Kladen neigen dazu, bei hypoxischen Bedingungen (~0,5 mg L−1) ihren Höhepunkt zu erreichen, möglicherweise weil diese Wässer sowohl ausreichend Elektronendonatoren (Wasserstoff, Methan, Schwefel) als auch Elektronenakzeptoren (Sauerstoff, Nitrat) enthalten. n ist in f angegeben und gilt für alle Panels.

Wir haben Hydrogenophaga in den meisten Grundwasserleitern in hoher relativer Häufigkeit nachgewiesen (Abb. 6b, 7, 8a). Hydrogenophaga-MAGs enthielten Gene, die für Hydrogenasen, Oxidasen und RuBisCO kodierten, aber auch einen Schwefeloxidationsweg (sqr, fccAB, soeABC, soxABX), einen vollständigen Denitrifikationsweg (in 2 von 4 MAGs) und eine aerobe Kohlenmonoxiddehydrogenase (coxSML), was darauf hindeutet ein fakultativ anaerober lithoautotropher Lebensstil. Mikroorganismen, die mit aeroben oder denitrifizierenden methano- und methylotrophen Bakterien assoziiert sind, waren ebenfalls in allen Grundwasserleitern reichlich vorhanden, insbesondere in älteren Grundwässern (Abb. 6b, ergänzende Abb. 8). Methylotrophe Methylotenera sp. waren die am häufigsten vorkommenden Populationen in den ASV-Datensätzen, gefolgt von methanoxidierenden Mitgliedern der Gattung Methylobacter. Beide Gattungen kamen auch in den Metagenomen der fünf Vertiefungen häufig vor und wurden durch neun MAGs repräsentiert. Methylobacter MAGs verfügten über vollständige Wege für die Oxidation von Methan zu Kohlendioxid, einschließlich der entscheidenden Aktivierung von Methan mit molekularem Sauerstoff über die partikuläre Methanmonooxygenase (pmoABC). Kürzlich wurde vermutet, dass Methylobacter unter hypoxischen Bedingungen die Methanoxidation mit der Denitrifikation koppeln kann38. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass diese Organismen zur teilweisen Denitrifizierung von Nitrit zu Lachgas fähig sind. Methylotenera-MAGs enthielten Gene, die Methanol zu Kohlendioxid oxidierten und Nitrat zu Nitrit reduzierten (Abb. 7). Über Denitrifikation durch Methylotenera wurde bereits berichtet39 und daher könnte Methylotenera Methylobacter mit Nitrit versorgen, während Methylobacter Methylotenera mit Methanol versorgt. Komplementäre Wechselwirkungen zwischen Methylobacter und Methylotenera wurden in einem methanreichen flachen Grundwasserleiter40, einem See41 sowie in methanotrophen Anreicherungskulturen42 beobachtet. Die Stoffwechselkapazitäten des Konsortiums legen jedoch nahe, dass molekularer Sauerstoff verfügbar sein muss, um die anfängliche Aktivierung von Methan zu katalysieren, auch wenn nachfolgende Schritte an die Denitrifikation gekoppelt werden können. Methylicorpusculum sp. (MAG-05) schien im Gegensatz dazu überhaupt nicht in der Lage zu sein, andere Elektronenakzeptoren als Sauerstoff zu verwenden (Abb. 7). Aerobe Methanoxidationsmittel der Gattung Crenothrix43 waren die vierthäufigsten Methanotrophen und kamen in fast der Hälfte der ASV-Datensätze vor (45 von 109, ergänzende Abbildung 8, ergänzende Daten 6). Crenothrix sp. sind filamentöse Mikroben, die im Grundwasser vorkommen können und möglicherweise die mit dem Mikroskop in vielen Proben beobachteten filamentösen Zellen darstellen (ergänzende Abbildung 3). Wir haben auch drei hochwertige MAGs der nicht kultivierten Gattung JABFRC01 innerhalb der Methylomonadaceae (MAG-06 – 08) gefunden. Diese MAGs kodierten eine lösliche und eine partikuläre Methanmonooxygenase und einen vollständigen Methanoxidationsweg, was zeigt, dass der Organismus ein aerober Methanoxidierer ist, der Sauerstoff für die anfängliche Oxidation von Methan zu Methanol benötigt. Wie der eng verwandte Methylobacter können die mit JABFRC01 assoziierten Organismen Nitrit als alternativen Elektronenakzeptor für die weitere Oxidation von Methanol zu Kohlendioxid unter hypoxischen Bedingungen verwenden (Abb. 7, Zusatzdaten 5). Von den zwanzig am häufigsten vorkommenden Bakteriengattungen, von denen bekannt ist, dass sie Ein-Kohlenstoff-Verbindungen oxidieren (ergänzende Abbildung 8), waren zwölf mit der Oxidation von Methanol, Methylaminen und anderen Methylverbindungen verbunden, während acht mit der Methanoxidation verbunden waren. Das weit verbreitete Vorkommen von Mikroorganismen, die zur aeroben Methanotrophie fähig sind, bestätigt frühere Erkenntnisse zur aeroben Methanotrophe-Aktivität in Kohleflözformationen47,48, wobei unsere Studie diesen Befund auf Grundwasserleiter in vielfältigeren geologischen Umgebungen und in einem viel größeren geografischen Maßstab ausdehnt.

Schwefeloxidierende Bakterien, darunter Sulfuricurvum sp., Thiobacillus sp., Thiomicrorhabdus und Sulfurimonas, waren in den untersuchten Grundwasserleitern ebenfalls weit verbreitet und reichlich vorhanden (Abb. 6c, ergänzende Abb. 10). Thiobacillus (MAG-20) war in der Lage, Sulfid und Thiosulfat mit Sauerstoff zu Sulfat zu oxidieren, verfügte aber auch über einen vollständigen Nitratreduktionsweg (Abb. 7). Ein ähnlicher Lebensstil war für PFJX01 innerhalb der Zugehörigkeit zu Thiobacillaceae (MAG-21), Sulfurimicrobium (MAG-22), Rhodoferax (MAG-23, −24), UBA2250 (MAG-26, −27) und ETT8 (MAG-29) wahrscheinlich mit Rhodocyclaceae und Rhodobacteraceae. Es wurde gezeigt, dass einige Mitglieder dieser Kladen aktive fakultativ anaerobe denitrifizierende Schwefeloxidationsmittel im terrestrischen Untergrund sind49,50. Der vielseitige Schwefelstoffwechsel dieser Kladen könnte frühere Beobachtungen der Pyritoxidation14 sowie das Vorhandensein von Schwefelreduzierern wie Desulfuromonas erklären, die elementaren Schwefel51 reduzieren und den Sulfidpool wieder auffüllen können.

Wir fanden obligat aerobes Ammonium oxidierendes Nitrosomonas, dessen MAG ein partielles pmoA/amoA und ein hao kodierte, um Ammonium zu Stickoxid zu oxidieren (Supplementary Data 5). Wie die Aktivierung von Methan benötigt auch die Ammoniummonooxygenase molekularen Sauerstoff. Die von den verschiedenen, koexistierenden Autotrophen produzierte Biomasse kann wiederum eine Vielzahl archaischer und bakterieller Heterotrophen unterstützen, darunter DPANN-Archaeen und Patescibakterien. Zahlreiche MAGs repräsentierten Flavobacterias, Cytophagales, Chitinophagales und Bacteroidales, Heterotrophe mit Appetit auf Oligosaccharide und die notwendigen Transportsysteme. In der Archaealgemeinschaft waren aerobe Woesearchaeales in allen Grundwasserleitern mit Ausnahme derjenigen mit altem Grundwasser besonders vielfältig und häufig anzutreffen, und in der Bakteriengemeinschaft waren potenziell heterotrophe Comamonadaceae und Pseudomonadaceae ebenfalls sehr häufig anzutreffen (ergänzende Abbildung 14b, c). Heterotrophe Gruppen remineralisieren organische Kohlenstoffverbindungen zu Kohlendioxid, das dann von hydrotrophen Methanogenen und anderen Autotrophen zur Produktion von Biomasse recycelt werden könnte.

Wenn Wasser durch Wiederauffüllungszonen eindringt und durch die Grundwasserleiter fließt, wird der gelöste Sauerstoff (DO; ursprünglich angenommen, dass er sich im Sättigungsgleichgewicht befindet) durch mikrobielle Atmung, Zersetzung organischer Stoffe oder durch Reaktion mit reduzierten Mineralien verbraucht52. Durch diese sauerstoffverbrauchenden Reaktionen sinkt der DO-Gehalt des Grundwassers häufig unter die Nachweisgrenze, insbesondere in Grundwasser mit langen Verweilzeiten, das über viele Jahre, Jahrhunderte oder sogar Jahrtausende hinweg keinen Kontakt zur Atmosphäre hatte52,53. Zu unserer Überraschung stellten wir in den meisten Grundwasserproben niedrige Konzentrationen von DO fest, auch in denen tieferer Grundwasserleiter, die geochemisch ausgereiftes Grundwasser enthalten (Abb. 9a). Unter Verwendung der bekannten Stöchiometrie relevanter mikrobieller Metabolismen haben wir geschätzt, dass der verbrauchte Sauerstoff (DO-Sättigung bei Infiltration minus gemessene DO-Konzentration in den erhaltenen Proben) mehr mikrobielle Zellen aufrechterhalten könnte, als wir in 85 % der Grundwasserleiter beobachteten (59 von 70; ergänzende Daten 8). ). In den übrigen 11 Grundwasserleitern lag der DO-Gehalt unterhalb der Nachweisgrenze. Das Vorkommen von mehr als 0,3 mg L−1 DO in vielen alten Grundwässern tieferer und begrenzter Grundwasserleiter war bemerkenswert und lässt darauf schließen, dass Sauerstoff in Ökosystemen vorhanden ist, von denen oft angenommen wird, dass sie anoxisch sind52,54.

a Tiefenprofil und gelöster Sauerstoffkonzentration (mg L−1) in den Grundwasserproben. b 18O-O2-Isotopensignatur über dem Sauerstoff:Argon-Verhältnis (O2/Ar). Die Zusammensetzung von Laborluft-äquilibriertem Wasser und Laborluft wird durch einen grauen bzw. schwarzen Kreis dargestellt. Fehlerbalken entsprechen einer Standardabweichung (basierend auf wiederholter Analyse der Laborluft, n = 13) und sind kleiner als die Symbole. Die blauen und schwarzen durchgezogenen Linien zeigen unterschiedliche Isotopeneffekte, die durch Fraktionierung (e) aufgrund der Atmung (bzw.) verursacht würden. Während des O2-Verbrauchs durch die Atmung (sinkendes O2:Ar-Verhältnis) kommt es zu einer bevorzugten Anreicherung von 18O im verbleibenden O2-Pool, was zu einem höheren δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\ mathrm{O}}}}_{2}}\) Werte. Da der Grad dieser Isotopenfraktionierung variieren kann, stellen die beiden durchgezogenen Linien zwei hypothetische, aber realistische Szenarien dafür dar, wie sich der O2-Pool durch die mikrobielle Atmung verändern könnte. Die schwarze gestrichelte Linie stellt eine Mischungslinie zwischen luftgleichgewichtigem Wasser und einer hypothetischen „neuen O2-Quelle“ dar, die ein sehr niedriges δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\mathrm{ O}}}}_{2}}\) (−20‰ vs. V-SMOW). Solch isotopenleichter Sauerstoff steht im Einklang mit der biologischen Bildung von O2. V-SMOW Wiener Standardmittelmeerwasser.

Um zu untersuchen, ob bei der Probenahme möglicherweise Sauerstoff eingetragen wurde, führten wir Sauerstoffisotopenanalysen von molekularem Sauerstoff (O2) durch. Tatsächlich stimmten einige Sauerstoffisotopendaten für DO mit Grundwasser überein, das im Gleichgewicht mit atmosphärischem Sauerstoff steht (δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\mathrm{O}}}}_{2 }}\) = ~+23,9‰ ± 0,1‰, Abb. 9b), was auf eine Luftverschmutzung während der Probenahme oder das Vorhandensein von atmosphärischem Sauerstoff in den Grundwasserleitern hinweist. Allerdings beobachteten wir an bestimmten Standorten (GW218, GW265) deutlich niedrigere δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{\mathrm{O}}}}_{2}}\)-Werte ( so niedrig wie +21‰), während gleichzeitig erhöhte O2:Ar-Verhältnisse gefunden wurden (Abb. 9b). Die niedrigeren δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\mathrm{O}}}}_{2}}\) und höheren O2:Ar-Verhältnisse fielen interessanterweise entlang eines Trends, der das darstellt simulierte Zugabe von DO mit einem δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\mathrm{O}}}}_{2}}\)-Wert, der viel niedriger ist als der von Wasser im Luftgleichgewicht (gestrichelte Trendlinie in Abb. 9b). Die Variation zwischen den dreifachen Proben kann durch das variable Vorhandensein von atmosphärischem Sauerstoff und/oder durch unterschiedliche mikrobielle Atmung erklärt werden, was den O2:Ar-Gehalt verringert und δ18\({{{\mathrm{O}}}}_ erhöht. {{{{\mathrm{O}}}}_{2}}\) Werte. Tatsächlich sind wahrscheinlich sowohl Mischungs- als auch biologische Prozesse am Werk. Am bemerkenswertesten ist jedoch, dass es unseres Wissens kein plausibles Szenario gibt, in dem Luftverschmutzung oder mikrobielle Atmung zu dem beobachteten zunehmenden Trend des O2:Ar-Verhältnisses in Verbindung mit sinkendem δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{ {{{\mathrm{O}}}}_{2}}\) Werte. Das heißt, eine Luftverunreinigung würde die O2:Ar-Verhältnisse und δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\mathrm{O}}}}_{2}}\) wieder in Richtung Luft bringen. Gleichgewichtswerte von +23,9‰55, während der mikrobielle Verbrauch von Sauerstoff O2:Ar senken und gleichzeitig δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\mathrm{O}}}_{2} erhöhen würde }\)56. Die sparsamste Erklärung für den beobachteten Trend wäre die In-situ-Produktion von O2 mit einem sehr geringen δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\mathrm{O}}}}_{ 2}}\) (z. B. −20‰). Angesichts des niedrigen δ18O (von H2O) des Grundwassers in Alberta (−18,6 ‰ ± −2,0 ‰; Mittelwert ± SD; n = 144, Ergänzende Daten 1), das die Sauerstoffquelle für jede In-situ-Produktion von O2 wäre, selbst eine kleine Produktionsmenge hätte einen großen Einfluss auf die Senkung des Gesamt-δ18\({{{\mathrm{O}}}}_{{{{\mathrm{O}}}}_{2}}\) in Grundwasser, in Richtung unserer Beobachtungen. In Abwesenheit von Licht kann Sauerstoff durch Wasserradiolyse57 oder mikrobiell durch Chlorit-Dismutation58, Stickoxid-Dismutation28,59 und H2O2-Dismutation60 erzeugt werden.

Mikroben können O2 durch Chloritdismutation produzieren, ein Prozess, der unter anderem von Mikroben der Gattungen Dechloromonas58, Dechlorobacter, Dechlorosoma, Azospira, Azospirillum61, Nitrospina und Nitrobacter durchgeführt wird, die alle auf der Grundlage der 16S-rRNA-Genanalysen in den GOWN-Grundwasserleitern vorhanden waren. ASVs, die zur Gattung Dechloromonas gehören, gehörten zu den am häufigsten vorkommenden in der Studie und machten in einigen Proben bis zu 30 % aller Bakteriensequenzen aus. Wir fanden 13 Chloritdismutase-Gene hauptsächlich von Dechloromonas-, Nitrospina-, Nakamurella- und Magnetospirillum-Arten in alten, anoxischen/hypoxischen (DO: 0–0,55 mg L−1) Grundwässern von GW144, GW218, GW265 und GW972 (Supplementary Data 9). Die Chlorit-Dismutase-Gene wurden in beträchtlichen Sequenzierungstiefen im Bereich von 4 bis 212x nachgewiesen, was auf eine mäßige bis hohe Häufigkeit der Organismen mit diesem Gen hinweist. Insbesondere zwei Chlorit-Dismutasen, die Magnetospirillum zugeordnet wurden, hatten eine sehr hohe Sequenzierungstiefe (207× und 212×). Grundwasser kann auch eine große Vielfalt an Stickoxid-Dismutationsgenen enthalten62 und in vielen Proben waren Mikroben vorhanden, die mit Methylomirabilaceae assoziiert sind und möglicherweise Stickoxid dismutieren können. Wir fanden auch Stickoxid-Dismutase-Gene (nod) in hochwertigen MAGs von Sediminibacterium (MAG-30) und Algoriphagus (MAG-31; Abb. 7; Ergänzende Daten 9). Es wurde kürzlich gezeigt, dass beide Abstammungslinien ein Nicken haben63. Das mit Sediminibacterium assoziierte Nicken wurde in einer Tiefe von 700x sequenziert, was die sehr hohe Häufigkeit von Sediminibacterium in der Gemeinschaft (12 %) bestätigt. Stickoxidreduktase ist mit Nicken verwandt, kann aber durch mehrere diagnostische Aminosäurereste im aktiven Zentrum des Enzyms identifiziert und unterschieden werden (ergänzende Abbildung 15). Kürzlich wurde gezeigt, dass Stickstoffmonoxid dismutierendes Nitrosopumilus sp. kann intrazellulär produzierten Sauerstoff in das Medium abgeben und möglicherweise andere aerobe Organismen unterstützen59. Es wurde auch berichtet, dass sogar Pseudomonas aeruginosa in der Lage zu sein scheint, Stickoxid zu dismutieren und Spitzenwerte von bis zu 20 µM Sauerstoff an seine Umgebung abzugeben64. Abstammungslinien, die sowohl mit Nitrosopumilus als auch mit Pseudomonas in Zusammenhang stehen, waren in den untersuchten Grundwässern weit verbreitet und reichlich vorhanden. Die in den untersuchten Grundwasserleitern reichlich vorhandenen membrangebundenen Dismutasen und deren Freisetzung von Sauerstoff in die Umgebung könnten das beobachtete Vorhandensein von 18O-abgereichertem Sauerstoff in alten Grundwässern erklären.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Wasserstoff eine grundlegende Energiequelle ist, die ein reichhaltiges Mosaik mikrobieller Stoffwechselvorgänge antreibt. Die umfangreiche mikrobielle Produktivität in den untersuchten Grundwasserökosystemen (Abb. 10) unterstreicht die Bedeutung von Wasserstoff im terrestrischen Untergrund65. Hydrogenotrophe Methanogene produzieren Methan, was wiederum die hohe Häufigkeit von Methanotrophen und die weit verbreiteten Gene erklärt, die an der Methantrophie beteiligt sind. Eine erhebliche aerobe und anaerobe Methanoxidation kann die Treibhausgasemissionen aus Grundwasserleitern, die Kohleflöze und Schiefer enthalten, reduzieren, was für die Kohlenstoffbilanz und den Klimawandel relevant ist. Wasserstoff scheint auch einen umfassenden mikrobiellen Schwefelkreislauf voranzutreiben. Sulfatreduzierer produzieren Sulfid, das dann von thiotrophen Mikroben oxidiert wird, indem sie in ihren Stoffwechselwegen entweder Sauerstoff oder Nitrat als Elektronenakzeptor verwenden. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft, die nachgewiesenen Stoffwechselfähigkeiten sowie die Wasser- und Isotopengeochemie stimmen alle überein und legen nahe, dass mikrobielle Gemeinschaften im Grundwasser die gesamte Bandbreite des bekannten biochemisch verfügbaren Redoxpotentials nutzen, von Wasserstoff bis Sauerstoff. Anders als in vielen anderen Grundwasserleitern, in denen die Zellzahl mit zunehmendem Alter des Grundwassers abnimmt, stieg die Zellzahl im Grundwasser aus Grundwasserleitern in Alberta mit zunehmendem Alter an, was bestätigt, dass diese Grundwasserleitergemeinschaften von autochthonen Energiequellen aus dem Untergrund angetrieben werden. Angesichts der Größe des untersuchten Gebiets kommen wir zu dem Schluss, dass die globale Biomasse unter der Oberfläche möglicherweise unterschätzt wird, insbesondere in Grundwasserleitern, die organische kohlenstoffreiche Schichten wie Kohleflöze und Schiefer enthalten. Die geochemischen und mikrobiologischen Daten legen nahe, dass Sauerstoff ein wichtiger Elektronenakzeptor für den mikrobiellen Stoffwechsel in den untersuchten Grundwasserleitern ist. Über das Vorhandensein aerober Mikroben in tiefen Grundwasserleitern und im Grundgestein wurde bereits berichtet66, die Mechanismen der tiefen Sauerstoffmigration oder der In-situ-Produktion bleiben jedoch unklar. Während die gleichzeitige Migration von etwas Sauerstoff mit dem alternden Grundwasser theoretisch die beobachtete mikrobielle Produktivität erklären könnte, deuten die vorgestellten Sauerstoffisotopenanalysen und die Häufigkeit mikrobieller Dismutase-Gene, die Sauerstoff produzieren können, darauf hin, dass zumindest ein Teil des Sauerstoffs in situ erzeugt wird . Die meisten der hier untersuchten hypoxischen Gewässer sind basierend auf Tritium- und 14C-Daten mehrere tausend bis >10.000 Jahre alt, was darauf hindeutet, dass selbst tiefe Ökosysteme unter der Oberfläche Nischen für aerobe Mikroorganismen bieten67. Die Produktion von dunklem Sauerstoff, die wir in dieser Arbeit postulieren, könnte einen Mechanismus für zuvor berichtete isotopenhelle Sauerstoffanomalien im Grundwasser darstellen, für die es bislang keine eindeutige Erklärung gibt52,54,68,69,70,71. Die mikrobielle Produktion von dunklem Sauerstoff in unterirdischen Ökosystemen könnte daher für die Funktion und Entwicklung der Geobiosphäre relevant sein, da sie sowohl auf der Erde als auch möglicherweise auf anderen Himmelskörpern eine lichtunabhängige Sauerstoffquelle darstellt.

a Relative Sequenzhäufigkeit mikrobieller Gilden. ANME: Anaerobe Methan-oxidierende Archaeen b Schematischer Überblick über den Elementkreislauf, abgeleitet aus mikrobiologischen und geochemischen Analysen. Die Zahlen beziehen sich auf die wichtigsten mikrobiellen Gattungen und ihre potenzielle Funktion, die in c aufgeführt sind. CH2O: Biomasse, H2: Wasserstoff, H2O: Wasser, CO2: Kohlendioxid, CH4: Methan, CH3OH: Methanol, SO42−: Sulfat, H2S: Sulfid, NO3−: Nitrat, NO2−: Nitrit, N2: Stickstoff, NH4+: Ammonium, Mn: Mangan, Fe: Eisen. c Mikrobielle Abstammungslinien und ihre potenzielle Funktion. Die Liste der Mikroben ist nicht vollständig und enthält hauptsächlich die am häufigsten vorkommenden Gattungen, die in dieser Studie beobachtet wurden. Prozesse in b, die mit weißen Kreisen dargestellt sind, werden durch Geochemie und/oder Metabarcodierung unterstützt, und Prozesse, die durch hellgrüne Kreise dargestellt sind, werden zusätzlich durch die jeweiligen Stoffwechselfähigkeiten unterstützt, die in metagenomassemblierten Genomen vorhanden sind.

Ungefähr 40–90 Grundwasserbrunnen werden jährlich von Alberta Environment and Protected Areas8 auf ihre Wasserqualität untersucht und auf eine Vielzahl geochemischer, isotopischer und mikrobieller Parameter analysiert. Für diese Studie analysierten wir 138 Grundwasserproben aus 95 Überwachungsbrunnen, die von Januar 2016 bis Juli 2020 beprobt wurden. 38 Brunnen werden innerhalb neogen-quartärer Oberflächenablagerungen untersucht, während 57 Brunnen sedimentäres Grundgestein erreichen, das normalerweise aus dem Paläogen oder der Kreidezeit stammt (Ergänzende Daten 1). . Die Brunnentiefen in dieser Studie lagen zwischen fünf und 231 m (Mittelwert = 60 m). Zu den Sedimentgesteinen, in denen Grundwasserüberwachungsbrunnen fertiggestellt werden, gehören Paskapoo und Äquivalent (n = 25), Horseshoe Canyon und Äquivalent (n = 13), Belly River Group (n = 9), Bearpaw (n = 4), Milk River ( n = 3) und Loon River (n = 2) Formationen. Einer Bohrung war keine geologische Formation zugeordnet. Weitere Einzelheiten zur Lage und Geologie finden Sie im SI.

Alle Bohrlöcher wurden mindestens einmal beprobt, während ausgewählte Bohrlöcher zu verschiedenen Jahreszeiten (bis zu drei) oder wiederholt beprobt wurden, um Probenwiederholungen zu erhalten (bis zu drei). Einige Bohrlöcher wurden als Cluster installiert, wobei mehrere Bohrlöcher (bis zu drei) am selben Standort in unterschiedlichen Tiefen innerhalb derselben Formation oder über mehrere Formationen hinweg fertiggestellt wurden. Alle Bohrlöcher wurden gespült, um die Probenqualität72 zu verbessern, und Proben wurden gesammelt, nachdem sich die Feldparameter (gelöster Sauerstoff – DO, Oxidations-Reduktionspotential – ORP, Temperatur, elektrische Leitfähigkeit – EC) stabilisiert hatten, was auf repräsentatives Grundwasser hinweist. In allen Vertiefungen wurden nach dem gleichen Verfahren Proben entnommen und die Proben bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C gelagert. Abhängig vom Standort der Bohrlöcher waren die Proben zwischen 1 und 7 Tagen bei 4 °C unterwegs. Proben von Tritium (3H) und Kohlenstoff-14 von gelöstem anorganischem Kohlenstoff (14CDIC) wurden mit einer Tauchpumpe (SP) gesammelt. Proben für andere Wasserqualitätsparameter, Isotope, gelöstes Gas und mikrobiologische Proben wurden mit einer Blasenpumpe (BP) gesammelt. Der SP wird zum Spülen und zur Probenentnahme 2 m unter der erwarteten Absenkebene platziert. Die Tauchpumpe verfügt über Polyethylenschläuche, die nicht gereinigt werden, und Nalgene-Schläuche, die mit einem allgemeinen Laborreiniger (Sparclean) gereinigt und anschließend mit hochreinem (18 MΩ) Wasser gespült wurden. Der BP wird zur Probenentnahme entweder in der Nähe des SP oder direkt über dem abgeschirmten Bereich platziert und verfügt über mit Säure gewaschene, mit Methanol und Reinstwasser gespülte Teflonschläuche. Für mikrobiologische Analysen haben wir 1000 ml Grundwasser in einer sterilen Nalgene-Flasche gesammelt. Die Probe wurde bei 4 °C an das Labor geschickt und zur Kryokonservierung mikrobieller Zellen, zur Zählung mikrobieller Zellen und zur Nukleinsäureextraktion verwendet.

Messungen des gelösten Sauerstoffs wurden mit Multiparameter-Sonden zur kontinuierlichen Wasserqualitätsüberwachung durchgeführt, die über lebensdauerbasierte optische Lumineszenzsensoren mit einer Auflösung von 0,01 mg L−1 und einer Genauigkeit von ±0,1 mg L−1 verfügen. Die spezifischen Sonden und Sensoren, die während der Probenahmekampagnen 2016–2017 verwendet wurden, waren ein YSI 6600 XLM (Dissolved Oxygen – ROX; YSI, Yellow Springs, USA), EXO1 oder EXO2 (Optical Dissolved Oxygen Smart Sensor; YSI, Yellow Springs, USA). In-Situ AquaTROLL 600 (robuster Sensor für gelösten Sauerstoff mit RDO-X-Kappe; In-situ, Fort Collins, USA) oder ein Ott Hydrolab DS5X (Hach LDO; Hach, Düsseldorf, Deutschland). Der Probenschlauch wurde an einen Durchfluss von ca. 400–900 ml durch die Zelle angeschlossen und die Feldparameter wurden in Intervallen von 1–2 Minuten protokolliert, so dass zwischen den Messwerten ein volles Wasservolumen verdrängt wurde, wobei der Standardmodus oder der beschleunigte Mittelungsmodus (5–40) verwendet wurde zweite Filterung), bis eine Parameterstabilisierung (±0,2–0,3 mg L−1) für 15 aufeinanderfolgende Messwerte erreicht wurde.

Vor jeder Exkursion wurden im Labor Kalibrierungen der Sensoren für gelösten Sauerstoff durchgeführt. Kalibrierungen für wassergesättigte Luft wurden gemäß den Benutzerhandbüchern der Sonden YSI EXO oder 6-Series (YSI, Yellow Springs, USA) und Aqua TROLL 600 (In-situ, Fort Collins, USA) oder luftgesättigtes Wasser durchgeführt gemäß der Bedienungsanleitung des Hydrolab DSX6, DS6 und MS6 (Hach, Düsseldorf, Deutschland). Für wassergesättigte Luft wurde der Kalibrierbecher mit 1/8 bis ½ Zoll Leitungswasser gefüllt. Ein sauberer und trockener Sensor für gelösten Sauerstoff wurde auf Schäden und Risse untersucht und dann mit einem sauberen Kalibrierungsschutz abgedeckt. Der Sensor und der Schutz wurden in den Kalibrierbecher eingesetzt und lose an der Sonde befestigt, um eine Entlüftung zu ermöglichen. Der Aufbau wurde 2–15 Minuten lang ohne direkte Sonneneinstrahlung ruhen gelassen, damit sich Temperatur und Druck mit wassergesättigter Luft ausgleichen konnten. Für luftgesättigtes Wasser wurde 1 l Wasser mit Raumtemperatur, das sich mindestens 12 Stunden lang im Gleichgewicht mit dem atmosphärischen Druck befunden hatte, eine Minute lang kräftig geschüttelt und in den Kalibrierungsbecher mit der Hach LDO-Sensorkappe (Hach, Düsseldorf, Deutschland) gegossen ) und der Temperatursensor vollständig eingetaucht ist. Der Kalibrierbecherdeckel wurde leicht über den Kalibrierbecher gelegt, um einen Luftaustausch zu ermöglichen, und 3–5 Minuten lang vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt. Der Luftdruck wurde mit einem Barometer in einem EXO-Handgerät (YSI, Yellow Springs, USA) oder einem digitalen Barometer Vaisala PTB220 (Vaisala Oyj, Vantaa, Finnland) gemessen, im Kalibrierungsprotokoll aufgezeichnet und in mmHg in die Kalibrierungssoftware eingegeben. Für wassergesättigte Luft bzw. luftgesättigtes Wasser wurde eine Einpunktkalibrierung durchgeführt. Die Messwerte wurden beobachtet, bis sie sich 40 Sekunden lang stabilisierten, der aktuelle Wert wurde im Kalibrierungsprotokoll aufgezeichnet und der Kalibrierungspunkt wurde akzeptiert. Die prozentuale Sättigung wurde unter Verwendung der gemessenen Temperatur (Thermistor) und des Salzgehalts (Leitfähigkeitssensor) sowie Formeln aus Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater73 in mg L-1 umgerechnet. Der Zustand der Sensorkappe wurde durch Überwachung der optischen Zunahme des gelösten Sauerstoffs innerhalb von 0,7 bis 1,4 verfolgt und alle ~2 Jahre ausgetauscht.

Grundwasserproben für die wichtigsten Kationen und Anionen wurden in Polyethylenflaschen gesammelt und bei ALS Global mittels induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) bzw. Ionenchromatographie analysiert. Die Gesamtalkalität und die Phenolphthaleinalkalität wurden durch Titration bestimmt und anschließend die Bicarbonat- und Carbonatkonzentrationen berechnet. Gelöster organischer Kohlenstoff wurde durch Hochtemperaturverbrennung auf einem Gesamtkohlenstoffanalysator mit Infraroterkennung gemessen. Gelöste Spurenelementproben wurden vor Ort mithilfe von 0,45-μm-Inline-Kapselfiltern gefiltert, mit Salpetersäure auf einen pH-Wert <2 konserviert und bei InnoTech Alberta mittels ICP-MS analysiert.

Gelöste Gasproben wurden mit einer Blasenpumpe gesammelt. Evakuierte Serumflaschen aus Glas mit Bördelverschluss und Butylseptum, die mit Quecksilberchlorid konserviert waren, wurden durch Durchstechen des Septums mit einer Nadel gefüllt. Die Gaszusammensetzung wurde im Applied Geochemistry Laboratory der University of Calgary durch Gaschromatographie bestimmt. Der Gastrockenheitsparameter ist definiert als das Verhältnis zwischen den Konzentrationen von Methan und denen höherer n-Alkane. Die Isotopenzusammensetzung von Methan und Kohlendioxid wurde im Isotope Science Laboratory der University of Calgary mit einem ThermoFischer MAT 253 Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS), gekoppelt mit einem Trace GC Ultra und GC Isolink (ThermoFisher), analysiert und relativ zu V- angegeben. PDB für δ13C und V-SMOW für δ2H. Die Präzision der Kohlenstoffisotopenanalysen lag bei mehr als ±0,5‰ für Kohlenwasserstoffe, ±0,2‰ für Kohlendioxid und ±2‰ für δ2H von Methan.

Alle Proben für 14CDIC-Analysen wurden zur Analyse mittels Beschleuniger-Massenspektrometrie (AMS) an das AE Lalonde Laboratory in Ottawa geschickt. Beispiele für Vorbehandlungstechniken finden Sie in Lit. 74. Radiokarbonanalysen werden mit einem 3MV-Tandembeschleuniger-Massenspektrometer durchgeführt, das von High Voltage Engineering (HVE) gebaut wurde. Wir haben den fraktionierungskorrigierten Bruchteil Modern (den F14C-Wert) für Post-Bomben-14C-Daten gemäß den geänderten Konventionen verwendet75. Tritium (3H) ist ein radioaktives Wasserstoffisotop mit einer Halbwertszeit von 12,4 Jahren. Tritiumkonzentrationen werden in Tritiumeinheiten (TU) gemessen, wobei 1 TU als das Vorhandensein eines Tritiums in 1018 Wasserstoffatomen definiert ist. Für Proben aus der Probenahmekampagne 2016–2017 wurde Tritium in den gewonnenen Grundwasserproben im AE Lalonde Laboratory in Ottawa durch elektrolytische Anreicherung und die Standardmethode der Flüssigszintillationszählung mit einer Genauigkeit von 0,8 TU analysiert.

Die meisten stabilen Isotopenanalysen wurden im Isotope Science Laboratory der University of Calgary durchgeführt (https://www.ucalgary.ca/labs/isotope-science-lab/techniques). Isotopenproben aus gelöstem anorganischem Kohlenstoff (DIC) wurden vor Ort mithilfe eines Inline-0,2-µm-Kapselfilters gefiltert und in einer 125-ml-Klarglas-Flintflasche mit Kegelverschluss gesammelt. Aus DIC wurde durch Säureangriff CO2 erzeugt und δ13C wurde wie im Abschnitt „Gasanalysen“ beschrieben analysiert. Für die Isotopenzusammensetzung von Sulfat wurden die Proben vor Ort mit einem 0,2-μm-Inline-Kapselfilter gefiltert und in 1-Liter-HDPE-Kunststoffflaschen mit breiter Öffnung gesammelt. Gelöstes Sulfat wurde in Bariumsulfat umgewandelt und mit einem ThermoQuest Finnigan Delta Plus XL IRMS in Verbindung mit einem Fisons NA 1500-Elementaranalysator für δ34SSO4 und einem HEKAtech HT-Sauerstoffanalysator mit einem Zero Blank-Autosampler für δ18OSO4 analysiert. δ34SSO4 wird relativ zu V-CDT und δ18OSO4 relativ zu V-SMOW angegeben. Die Genauigkeiten für δ18OSO4 und δ34SSO4 betragen ±0,5‰. Die Isotopenzusammensetzung von Nitrat wurde anhand von N2O bestimmt, das durch die Denitrifier-Technik erzeugt wurde, unter Verwendung eines Thermo Scientific Delta V Plus IRMS gekoppelt mit einem Finnigan MAT PreCon. Die Genauigkeiten für δ15NNO3 und δ18ONO3 betragen ±0,3‰ bzw. ±0,7‰.

Proben für die Analyse der Sauerstoffisotopenverhältnisse von gelöstem O2 und Messungen des O2/Ar-Verhältnisses im Grundwasser aus Überwachungsbrunnen wurden direkt in 20-ml-Headspace-Fläschchen gefüllt, so dass viele Überlaufvolumina die mit 100 µL einer gesättigten Zinkchloridlösung vergiftete Luft verdrängen konnten. Schnell mit Butylsepten verschlossen (ohne Headspace-Blase). Im Labor wurde ein 5-ml-Kopfraum durch Ersetzen durch hochreines Helium geschaffen. Die Fläschchen wurden mehrere Tage lang mit Headspace auf einem Schütteltisch bei Raumtemperatur äquilibriert. Aliquots des Kopfraums (enthaltend O2 und Ar aus der Wasserprobe) wurden direkt in das Probeneinlasssystem (einschließlich einer 2 m, 5 Å Molekularsieb-GC-Säule) injiziert und in das Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (Isoprime 100, Multikollektor) geleitet ). Als Arbeitsstandards wurden Injektionen von Laborluft und mit Laborluft äquilibriertem Wasser verwendet. Basierend auf wiederholten Analysen betrug die Präzision der δ18O-Messungen ±0,1‰ und der O2/Ar-Messungen ±0,05.

Um die Zellen zu fixieren, fügten wir 4 ml Formaldehydlösung (37 %) zu einer 50 ml Grundwasserprobe (fc ~2,7 %) hinzu. Die Probe wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C gelagert. 1 ml Probe wurde in 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und auf einen Polycarbonatfilter (0,1 µm Porengröße, 25 mm Durchmesser, Millipore Sigma) unter Verwendung eines gemischten Celluloseester-Membranfilters (0,45 µm Porengröße, Sartorius) filtriert. als Unterstützung. Der Filter wurde mit 10 ml 1× PBS gespült, getrocknet und bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Ein Abschnitt jedes Filters wurde mit 1 µg mL−1 DAPI (4',6'-Diamidino-2-phenylindol) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt, mit entionisiertem Wasser und 80 % Ethanol gewaschen und getrocknet. Filterstücke wurden mit einer 4:1 Citifluor:Vectashield-Lösung (VWR und Vector Laboratories) auf Objektträger montiert und bei –20 °C gelagert. Die Zellen wurden mit einem Axio Imager A2 (Zeiss, Jena, Deutschland) sichtbar gemacht und gezählt, der mit einer Fluoreszenzlichtquelle X-Cite 120 LED (Excelitas, Waltham, USA) und einem 12,5 × 12,5 mm großen Augengitter ausgestattet war. Um einen robusten Datensatz zu erhalten, wurden ca. 40 Gitter pro Filter gezählt. Um die Zellzahl abzuschätzen, die pro Mol Sauerstoff aufrechterhalten werden kann (Ergänzungsdaten 8), haben wir veröffentlichte Werte für den mikrobiellen Zellgehalt76 und den Biomasseertrag77 verwendet.

100–400 ml Grundwasserprobe wurden 1 Stunde lang bei 4 ° C und 4000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Pellets in einem 2-ml-Röhrchen vereint und bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 °C gelagert. (Hinweis: Wir testeten gesammelte Zellen aus 8 Vertiefungen auch durch Filtration auf GTTP-Filtern mit einer Porengröße von 0,1 µm (Millipore Sigma), sequenzierten DNA und verglichen die Gemeinschaftsstrukturen mit denen der Pellets. Die Gemeinschaften waren nahezu identisch.) Genomische DNA wurde mit dem DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit (12855-100, QIAGEN) gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einer geringfügigen Modifikation extrahiert; Die Zellen wurden durch 45 s langes Perlenschlagen bei 4 m s−1 unter Verwendung eines Bead Ruptor 24 (OMNI) lysiert. Extraktionsrohlinge wurden verarbeitet, um mögliche Laborkontaminationen während der Extraktion zu erkennen. Die DNA-Konzentrationen wurden fluormetrisch unter Verwendung eines Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Kanada) gemessen. Die bakterielle 16S-rRNA-Gen-v3-4-Region wurde mit SD-Bact-0341-aS-17 (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') und SD-Bact-0785-aA-19 (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')78 amplifiziert . Die Region des archaealen 16S-rRNA-Gens v6-9 wurde mit dem Primerpaar SD-Arch-0915-aS-20/S-*-Univ-1392-aA-15 (5'-AGGAATTGGCGGGGGAGCAC-3', 5'-ACGGGCGGTGTGTRC-) amplifiziert. 3')78. PCRs bestanden aus 8 µL (1–10 ng) DNA-Matrize, 2,5 µL jedes Primers (fc 1 µM), 12,5 µL 2× Kapa HiFi HotStart Ready Mix (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA) und Wasser in PCR-Qualität 25 µL. Für Bakterien wurde ein Touchdown-PCR-Programm für ein verbessertes Annealing verwendet: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, 10 Zyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 45 Sekunden (Touchdown –1 °C pro Zyklus), 72 °C für 60 Sekunden, gefolgt von 20 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 45 Sekunden, 72 °C für 60 Sekunden und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Für Archaeen war das Touchdown-PCR-Programm: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, 10 Zyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, 62 °C für 45 Sekunden (Touchdown –1 °C pro Zyklus), 72 °C für 60 Sek., gefolgt von 20 Zyklen mit 95 °C für 30 Sek., 60 °C für 45 Sek., 72 °C für 60 Sek. und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Min. PCRs wurden dreifach durchgeführt, gepoolt und unter Verwendung von 56 µl Agencourt AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, Indianapolis, USA) pro gepooltem PCR-Produkt (~65–75 µl) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Amplikons wurden unter Verwendung von 5 µL gereinigtem PCR-Produkt, 5 µM jedes Indexprimers (fc 1 µM), 25 µL 2× Kapa HiFi HotStart Ready Mix und 10 µL Wasser in PCR-Qualität indiziert. Indexierendes PCR-Programm: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, 10 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 45 Sekunden, 72 °C für 60 Sekunden und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Indizierte Amplikons wurden mit Agencourt AMPure XP-Perlen gereinigt. Die Konzentration und Größe der indizierten Amplikons wurden mit einem Qubit 2.0-Fluorometer bzw. einem Agilent 2100 Bioanalyzer-System (Agilent Technologies, Mississauga, ON, Kanada) überprüft. Indizierte Amplikons wurden in äquimolaren Mengen gepoolt und nach der vollständigen DNA-Extraktion mit dem v3 600-Zyklus-Reagenzienkit (Paired-End, MS-102-3003) von Illumina auf einem Illumina MiSeq-Tischsequenzierer (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) sequenziert Es wurde bestätigt, dass Blindproben und PCR-Reagenzien-Leerproben eine negative Amplifikation aufweisen.

Rohe Amplikonsequenzen wurden mit DADA2 v1.1679 analysiert. Kurz gesagt, die Vorwärts- und Rückwärts-Lesevorgänge wurden auf 275 bp bzw. 205 bp qualitätsgekürzt und Primersequenzen (17 bp vorwärts, 21 bp rückwärts) entfernt. Lesevorgänge mit mehr als zwei erwarteten Fehlern wurden verworfen, gepaarte Lesevorgänge wurden zusammengeführt und chimäre Sequenzen wurden entfernt. Die Taxonomie auf Artenebene wurde mit silva_nr_v138_train_set und silva_species_assignment_v138 zugewiesen. Nach der Qualitätskontrolle und der Entfernung von Blindproben und technischen Replikaten erhielten wir 64 archaische und 110 bakterielle Amplikon-Datensätze. Archaeal-Datensätze enthielten insgesamt 3,89 × 105 Sequenzablesungen, die zu 2633 eindeutigen ASVs gehörten. Archaealproben hatten im Durchschnitt 6083 ± 6387 Messwerte (Mittelwert ± Standardabweichung) und 69 ± 81 ASVs (Supplementary Data 10). Die Bakteriendatensätze umfassten insgesamt 4,65 × 106 Sequenzablesungen, die zu 14665 eindeutigen ASVs gehörten. Bakterienproben hatten im Durchschnitt 4,23 ± 1,57 × 104 Lesevorgänge und 272 ± 221 eindeutige ASVs (Supplementary Data 11). Die Zusatzdaten 10 und 11 enthalten auch NCBI-Projekt- und Probenzugangsnummern für jeden Archaeen- und Bakteriendatensatz. Archaeale und bakterielle ASV-Nukleotidsequenzen und Taxonomie sind in den Zusatzdaten 12 bzw. 13 aufgeführt. Die archaeale oder bakterielle ASV-by-Probe-Tabelle (Supplementary Data 3, 4) wurde verwendet, um die Anzahl der beobachteten ASVs, absoluten Singletons, relativen Singletons, relativen Häufigkeit und Zusammensetzung zu bestimmen. Die Alpha-Diversität (Reichtum, Shannon-Entropie, inverse Simpson-Diversität und Chao1-geschätzte Vielfalt) wurde aus der ASV-by-Sample-Tabelle unter Verwendung eines Unterabtastungsansatzes berechnet, um ungleichen Stichprobenaufwand zu berücksichtigen. Wir verwendeten 1008 bzw. 6796 zufällig ausgewählte Messwerte aus jeder Archaeen- bzw. Bakterienprobe. Unterschiede in der Diversität zwischen Bedingungen wurden mit dem Wilcoxon-Signed-Rang-Test (ggsignif) getestet, wie er in ggplot280 implementiert ist. Bray-Curtis-Unähnlichkeiten zwischen allen Stichproben wurden berechnet und für zweidimensionale nichtmetrische mehrdimensionale Skalierungs-Ordinationen (NMDS) mit 20 zufälligen Starts verwendet. Je weiter zwei Stichproben (Kreise) im NMDS voneinander entfernt sind, desto unterschiedlicher sind ihre zugrunde liegenden Gemeinschaften. Umgebungsparameter wurden mit einer teilweisen Redundanzanalyse unter Verwendung von Hellinger-transformierten ASV-Daten getestet. Alle Analysen wurden mit VisuaR v02 (https://github.com/EmilRuff/VisuaR) durchgeführt, einem Workflow basierend auf der R-Statistikumgebung v4.1.0-v4.2.1, einschließlich unter anderem der Pakete vegan81, ggplot280 sowie Custom R Skripte. Der VisuaR-Workflow, die verwendeten Pakete und Versionen sind in Supplementary Data 14 verfügbar.

Metagenome wurden am Center for Health Genomics and Informatics der Cumming School of Medicine der University of Calgary verarbeitet und sequenziert. Genomische DNA wurde mit einem fokussierten S2-Ultraschallgerät (Covaris, Woburn, MA) in Fragmente mit ca. 350 bp zerschnitten. Bibliotheken wurden mit dem NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit für Illumina (E7103, New England Biolabs, Ipswich, MA) gemäß dem Protokoll des Herstellers vorbereitet, einschließlich Größenauswahl mit SPRIselect-Magnetkügelchen (B23318, Beckman Coulter, Indianapolis, IN) und PCR Anreicherung (acht Zyklen) mit NEBNext Multiplex Oligos für Illumina (E7335L, New England Biolabs, Ipswich, MA). Die DNA-Konzentrationen wurden mithilfe von qPCR und dem Kapa Library Quantitation Assay für Illumina (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) geschätzt. Genomische DNA wurde auf einem Illumina NovaSeq 600-Sequenziergerät (Illumina, San Diego, CA) unter Verwendung einer S1-Durchflusszelle mit 300 Zyklen (2 × 150 bp) sequenziert. Die Qualitätskontrolle wurde an rohen Paired-End-Illumina-Lesevorgängen mit BBDuk v38.9082 durchgeführt, einschließlich Trimmen, Filtern von Verunreinigungen und Abschneiden minderwertiger Enden. Lesevorgänge, die die Qualitätskontrolle bestanden haben, wurden mit Megahit v1.2.983 zu Contigs zusammengesetzt und Contigs mit <500 bp wurden in den nachfolgenden Schritten nicht berücksichtigt. Lesevorgänge aus jeder Probe wurden mit BBMap v38.9082 jeder der 5 Proben zugeordnet und Sequenzierungstiefenprofile wurden mit der Funktion „jgi_summarize_bam_contig_ Depths“ aus MetaBat2 v2.1584 generiert. Zusammengesetzte Contigs wurden mithilfe von MetaBat2, CONCOCT v1.1.085 und MaxBin2 v2.2.786 in Metagenome-Assembled-Genomes (MAGs) eingeteilt. DAS-Tool v1.1.387 wurde verwendet, um MAGs zu integrieren, die von den drei Binning-Tools erstellt wurden. Die MAG-Eigenschaften einschließlich Vollständigkeit und Kontamination wurden mit CheckM v1.2.088 bewertet. Um die relative Häufigkeit von MAGs abzuschätzen, haben wir mithilfe der Checkm-Abdeckung und des Checkm-Profils den Prozentsatz der Lesevorgänge bestimmt, die jedem Bin zugeordnet waren, und den Prozentsatz, der nicht in Bins zugeordneten Contigs zugeordnet war, und dann berechnet (% der dem Bin zugeordneten Lesevorgänge) * (100 − (% der zugeordneten Lesevorgänge). zu nicht gruppierten Contigs)). MAGs wurden mit GTDB-tk (Version 2.1.0, Datenbankversion r207)89 klassifiziert. Metagenomische Kurzablesungen wurden der SILVA SSU-Referenzdatenbank v13890 zugeordnet, um nächstgelegene taxonomische Einheiten zuzuordnen. Außerdem wurden 16S/18S-rRNA-Gensequenzen in voller Länge mit phyloFlash v3.491 aus Metagenomen rekonstruiert und mit Blastn v2.12.092 mit ASVs verglichen. Transfer-RNA, ribosomale RNA, CRISPR-Elemente und proteinkodierende Gene, einschließlich der kodierenden Gene für Stickoxiddismutase (nod) und Chloritdismutase (cld), wurden mit MetaErg v2.2.x93 vorhergesagt und annotiert. Aminosäuresequenzen auf Contigs wurden zusätzlich mit Blastp v2.12.0 (E-Wert 1e-10) anhand repräsentativer Nod- und Cld-Sequenzen von NCBI durchsucht und mit Clustal Omega v1.2.494 abgeglichen.

Um Kontaminationen zu vermeiden und zu überwachen, haben wir in jedem Schritt der Experimente Kontrollen eingebaut. Wir haben die Probenahmeausrüstung nach jeder Vertiefung sterilisiert, wir haben doppelte Blindkontrollen regulärer Wasserproben unter Verwendung verschlüsselter Probennamen hinzugefügt und wir haben Blindkontrollen für die Zellzählung und -sequenzierung beigefügt. Wir haben keine Hinweise darauf, dass durch die Probenhandhabung oder DNA-Extraktion Organismen eingeführt wurden, die bekannte Kontaminanten von Proben mit geringer Biomasse95 oder DNA-Extraktionskits96 sind. Die Lagerung in Nalgene-Flaschen, die möglicherweise einen Anreicherungseffekt hätte haben können, z. B. die Förderung des Wachstums aerober Organismen nach der Probenahme, hatte keinen Einfluss auf die Gemeinschaftsstruktur (ergänzende Abbildung 11), da Alpha-Diversität, Beta-Diversität und Zusammensetzung keine Unterschiede zeigten wenn sie in Kategorien gruppiert werden, die die Speicherdauer widerspiegeln.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten archaealen und bakteriellen 16S-rRNA-Amplikondaten wurden im NCBI SRA-Archiv unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA861683 hinterlegt. Die Shotgun-Metagenomdaten und Metagenom-assemblierten Genome (MAGs) wurden im SRA-Archiv unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA700657 hinterlegt. Die in dieser Studie generierten umfassenden Umweltdaten wurden im PANGEA-Archiv unter der Zugangsnummer 95247397 hinterlegt.

Die neueste Version des bioinformatischen Workflows VisuaR v02, der zur Durchführung von genbasierten 16S-rRNA-Community-Analysen verwendet wird, ist öffentlich auf Github verfügbar (https://github.com/EmilRuff/VisuaR). Die genauen VisuaR-Analysen, die in diesem Dokument vorgestellt werden, sind in hinterlegt Ergänzende Daten 14.

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Wir sind Joanna Borecki, James Rogans, Dennis Rollag, Vien Lam und anderen Wissenschaftlern und Mitarbeitern des Groundwater Observation Well Network, das von Alberta Environment and Protected Areas betrieben wird, sehr dankbar (https://www.alberta.ca/groundwater-observation- well-network.aspx) für die Bereitstellung des Zugangs zu Grundwasserüberwachungsbrunnen, für die Probenahme und Bereitstellung von Grundwasserproben höchster Qualität sowie für den Austausch von Messergebnissen und Fachwissen. Wir schätzen die Unterstützung und das Fachwissen von Carmen Li in Bezug auf die Nukleinsäuresequenzierung sehr. Wir danken Manuel Kleiner und Xiaoli Dong für Unterstützung und Diskussionen zur Bioinformatik sowie Ranjani Murali und Claire Elbon für Diskussionen zu Oxidasen und Dismutasen. Wir danken Anirban Chakraborty für Einblicke in die Probenhandhabung, Steven Taylor und Veith Becker für Unterstützung bei Isotopenmessungen und -interpretation sowie Rachel HR Stanley für Hilfe bei der Sauerstoffisotopen-Massenspektrometrie. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Simons Foundation (824763, SER), ein Alberta Innovates Technology Futures (AITF)/Eyes High Postdoctoral Fellowship (SER), Startgelder des Marine Biological Laboratory, Woods Hole (SER), unterstützt. von Alberta Innovates Energy and Environment Solution (AIEES) – Projekt: Geochemische Ressourcencharakterisierung des Grundwassers von Alberta (BM) und Alberta Innovates Water Innovation Program (AI-WIP) – Projekt: Vorkommen, Ursprung und Verbleib wässriger Schadstoffe im Grundwasser von Alberta ( BM) und vom Canada Research Chairs Program (CRC-2020-00257, MS).

Abteilung für Geowissenschaften, Universität Calgary, Calgary, Kanada

S. Emil Ruff, Pauline Humez, Isabella Hrabe de Angelis, Muhe Diao, Michael Nightingale, Sara Cho, Liam Connors, Olukayode O. Kuloyo, Cynthia N. McClain, Bernhard Mayer und Marc Strous

Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, USA

S. Emil Ruff

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S. Emil Ruff

Abteilung für Mehrphasenchemie, Max-Planck-Institut für Chemie, Mainz, Deutschland

Isabella Hrabe de Angelis

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Alan Seltzer, Samuel Bowman und Scott D. Wankel

Umwelt und Schutzgebiete in Alberta, Calgary, Kanada

Cynthia N. McClain

Alberta Biodiversity Monitoring Institute, Edmonton, Kanada

Cynthia N. McClain

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SER, BM und MS konzipierten die Studie. SER, PH, BM und MS sicherten sich die Finanzierung. Von SER, PH, CNM, IHdA, SDW, AS und MS entwickelte Methodik. Von SER, PH, IHdA, MN, MD, SC, LC, OOK, AS, SB und SDW verarbeitete Proben. SER, PH, IHdA, CNM, MD und SDW führten Analysen durch. SER, PH, IHdA, SDW visualisierte Daten. SER und MS betreuten beteiligte Studierende. SER und PH haben den ursprünglichen Manuskriptentwurf verfasst. Alle Autoren haben das Manuskript bearbeitet und verbessert.

Korrespondenz mit S. Emil Ruff.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ruff, SE, Humez, P., de Angelis, IH et al. Wasserstoff und dunkler Sauerstoff fördern die mikrobielle Produktivität in verschiedenen Grundwasserökosystemen. Nat Commun 14, 3194 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38523-4

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Eingegangen: 13. September 2022

Angenommen: 05. Mai 2023

Veröffentlicht: 13. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38523-4

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