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Jun 26, 2023

Synergistische antibakterielle Wirkung von Kupfer- und Silber-Nanopartikeln und ihr Wirkmechanismus

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 9202 (2023) Diesen Artikel zitieren 1046 Zugriffe 1 Zitationen Metrikdetails Bakterielle Infektionen sind eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Im Falle

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9202 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bakterielle Infektionen gehören weltweit zu den häufigsten Todesursachen. Bei topischen bakteriellen Infektionen wie Wundinfektionen ist Silber (Ag) seit jeher eines der am häufigsten eingesetzten antibakteriellen Mittel. Wissenschaftliche Veröffentlichungen haben jedoch die schädlichen Auswirkungen von Silber auf menschliche Zellen, Ökotoxizität und eine unzureichende antibakterielle Wirkung für die vollständige Beseitigung bakterieller Infektionen nachgewiesen. Die Verwendung von Ag in Form von Nanopartikeln (NPs, 1–100 nm) ermöglicht die Kontrolle der Freisetzung antibakterieller Ag-Ionen, reicht jedoch immer noch nicht aus, um Infektionen zu beseitigen und Zytotoxizität zu vermeiden. In dieser Studie haben wir die Wirksamkeit unterschiedlich funktionalisierter Kupferoxid-NPs (CuO) zur Verbesserung der antibakteriellen Eigenschaften von Ag-NPs getestet. Die antibakterielle Wirkung der Mischung von CuO-NPs (CuO-, CuO-NH2- und CuO-COOH-NPs) mit Ag-NPs (unbeschichtet und beschichtet) wurde untersucht. CuO- und Ag-NP-Kombinationen waren wirksamer als Cu oder Ag (NPs) allein gegen eine Vielzahl von Bakterien, darunter antibiotikaresistente Stämme wie gramnegative Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa sowie grampositive Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis und Streptococcus dysgalactiae. Wir haben gezeigt, dass positiv geladene CuO-NPs die antibakterielle Wirkung von Ag-NPs um das Sechsfache verstärkten. Bemerkenswerterweise war die Synergie der jeweiligen Metallionen im Vergleich zur Synergie von CuO- und Ag-NPs gering, was darauf hindeutet, dass die NP-Oberfläche für die verstärkte antibakterielle Wirkung erforderlich ist. Wir untersuchten auch die Mechanismen der Synergie und zeigten, dass die Produktion von Cu+-Ionen, eine schnellere Auflösung von Ag+ aus Ag-NPs und eine geringere Bindung von Ag+ durch Proteine ​​des Inkubationsmediums in Gegenwart von Cu2+ die Hauptmechanismen der Synergie waren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CuO- und Ag-NP-Kombinationen die antibakterielle Wirkung um das Sechsfache steigern konnten. Somit ermöglicht die Verwendung von CuO- und Ag-NP-Kombinationen die Beibehaltung hervorragender antibakterieller Wirkungen aufgrund von Ag und Synergien und verstärkt die positiven Effekte, da Cu ein lebenswichtiges Mikroelement für menschliche Zellen ist. Daher schlagen wir die Verwendung von Kombinationen aus Ag- und CuO-NPs in antibakteriellen Materialien, wie z. B. Wundversorgungsprodukten, vor, um die antibakterielle Wirkung von Ag zu erhöhen, die Sicherheit zu verbessern und topische bakterielle Infektionen zu verhindern und zu heilen.

Die Entwicklung neuer Antibiotika ist eine der obersten Prioritäten der Weltgesundheitsorganisation und der wissenschaftlichen Gemeinschaft1. Eine aktuelle Metaanalyse ergab, dass es im Jahr 2019 4,95 Millionen Todesfälle im Zusammenhang mit Antibiotikaresistenzen gab, und verdeutlichte die Notwendigkeit dringender Maßnahmen zur Bekämpfung antibiotikaresistenter bakterieller Infektionen2. Wundinfektionen sind eine Art chronischer Infektionen, die zu schwerwiegenden Folgen wie der Amputation von Gliedmaßen und, wenn sie nicht behandelt werden, zum Tod führen können. In 15–27 % der Fälle führt eine bakterielle Wundinfektion zu einer Gangrän, die eine Amputation der Gliedmaße erfordert.3 Dies zeigt, dass aktuelle Strategien zur Behandlung von Wundinfektionen ineffizient sind und verbesserte Ansätze erforderlich sind.

Im Bereich der klassischen Antibiotika gilt das kombinatorische synergistische Konzept derzeit als einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung bakterieller Infektionen und zur Vermeidung von Resistenzen4. Die Kombination verschiedener Medikamente ermöglicht eine Dosisreduktion der Medikamente und verursacht somit weniger Nebenwirkungen im Vergleich zur Monotherapie5.

Allerdings werden Antibiotika systemisch verabreicht und ihre Kombinationen weisen unvorhersehbare pharmakokinetische Profile auf. Topisch angewendete NP-Kombinationen würden diese Nachteile systemischer Antibiotika umgehen. Daher halten wir die Anwendung synergistischer NPs für sehr vielversprechend. Wir gehen davon aus, dass Cu- und Ag-NPs aufgrund der unterschiedlichen Wirkungsweisen auf Bakterien bei gemeinsamer Anwendung eine höhere antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, wohingegen Cu die antibakterielle Wirksamkeit von Ag-NPs – den besten bisher bekannten antibakteriellen Mitteln auf Metallbasis – verstärkt. Darüber hinaus ist Cu ein Mikroelement und wirkt sich positiv auf die Wundheilung aus, indem es die Migration von Fibroblasten stimuliert, die Kollagensynthese fördert, für die Angiogenese unerlässlich ist und die Wundheilung6 und die Knochenregeneration7 unterstützt. Somit könnten Cu- und Ag-NP-Kombinationen eine überlegene antibakterielle Wirkung haben, die Wundheilung verbessern und daher eine äußerst vorteilhafte Behandlung für infizierte Wunden darstellen.

Unabhängig davon sind die antibakteriellen Wirkungen von CuO- und Ag-NPs gut untersucht. Unter Verwendung der Schlüsselwörter „Silber-Nanopartikel*-Bakterien*“ oder „Kupfer-Nanopartikel*-Bakterien*“ ergab die am 23. März 2023 durchgeführte Suche in PubMed® 6.558 bzw. 1.113 Antworten.

Die antibakteriellen Mechanismen von Ag-NPs an sich sind relativ gut verstanden. Bei Kontakt mit Bakterien lokalisieren sich Ag-NPs an der Bakterienzellwand und oxidieren, was zu einer konzentrierten Ag-Freisetzung an der NP-Zell-Grenzfläche führt8. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Schädigung der Zellwand gramnegativer Bakterien durch Ag-NPs hauptsächlich an der Plasmamembran auftritt, wohingegen die äußere Membran der Bakterienzelle kein Ziel von NPs9 war.

Die molekularen Mechanismen von CuO-NPs sind weniger untersucht. Im Jahr 2008 stellten Heinlaan et al. zeigten, dass die Toxizität von CuO-NPs (EC50 = 79 mg/l) gegenüber dem Bakterium Vibrio fischeri, aber auch gegenüber Krebstieren auf gelöste Cu-Ionen zurückzuführen ist10. Trotz seiner hervorragenden antibakteriellen Wirkung ist die Toxizität von CuO für menschliche Zellen im Vergleich zur Toxizität von Ag und Ag-NPs geringer. Da Cu ein lebenswichtiges Mikroelement ist, ermöglichen CuO-NPs in einigen Fällen positive Effekte wie eine verbesserte Angiogenese und Wundheilung6. Detaillierte antibakterielle Mechanismen von CuO-NPs wurden unter Verwendung rekombinanter E. coli11 weiter untersucht. Im Gegensatz zu Ag-NPs, die unter abiotischen Bedingungen keine reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verursachten, induzierten CuO-NPs, insbesondere positiv geladene, erhebliche Mengen an ROS. Die Oberflächenladung von NPs kann durch Oberflächenfunktionalisierung leicht verändert werden und spielt eine Rolle bei der Inaktivierung von Bakterien. Da die Zellwand von Bakterien negativ geladen ist, können positiv geladene NPs besser an den Zellwänden der Bakterien haften und Bakterien effizienter inaktivieren.

Wir untersuchen seit 2008 antibakterielle NPs mit dem Ziel, die Toxizitätsmechanismen von NPs zu verstehen und ihre Wirksamkeit und Sicherheit zu erhöhen1,8,9,10,12,13,14. Aktuelle Artikel und unsere Forschung haben gezeigt, dass die antibakterielle Wirkung von NPs deutlich verstärkt werden kann, wenn metallbasierte NPs oder entsprechende Metalle in Kombination verwendet werden. Allerdings konzentrieren sich fast alle bisher veröffentlichten Arbeiten auf die kombinierten Effekte von Metallionen und nicht auf NPs15,16,17,18. Unter den verschiedenen untersuchten Metallkombinationen (Ag mit Cu, Zn, Co, Cd und Ni) hatte die Kombination von Ag und Cu die höchste synergistische antibakterielle Wirkung sowohl gegen gramnegative als auch gegen grampositive Bakterien19. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Synergie zwischen Cu und Ag, was in den letzten Jahren in mehr veröffentlichten Artikeln zum Ausdruck kam. Die meisten von ihnen beschrieben die antibakteriellen Eigenschaften von Nanolegierungen aus Cu/Ag20,21 oder Cu/Ag unter Zusatz einiger anderer Metalle, beispielsweise Wolfram22. Darüber hinaus haben Jang und al. zeigten perfekte antibakterielle Anti-Biofilm- und Wundheilungseigenschaften von Cu/Ag/Graphenoxid-Kompositen im Mausmodell mit infizierten Wunden23. Bemerkenswert ist, dass wir trotz dieser Artikel, die die antibakterielle Synergie zwischen Cu und Ag beschreiben, keine Veröffentlichungen identifiziert haben, die sich systematisch mit der Untersuchung der synergistischen Wirkung von NP-Kombinationen oder ihrer Mechanismen befassen.

In dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass der synergistische antibakterielle Mechanismus von CuO- und Ag-NPs durch ihre komplementären Wirkmechanismen angetrieben wird: Ag-NPs schädigen die Zellwände von Bakterien und erleichtern so den Eintritt von CuO-NPs in Bakterien, wo CuO-NPs intrazelluläre Moleküle zerstören. Genauer gesagt haben wir zunächst die synergistische antibakterielle Wirkung zwischen Ag- und CuO-NPs mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen gegen verschiedene Bakterien, einschließlich multiresistenter Bakterien, beschrieben. Zweitens führten wir eine Reihe von Tests durch, um die Mechanismen der antibakteriellen Synergie von NPs zu verstehen: Wir maßen die Schädigung der äußeren Membran, die Induktion von ROS, die Bioverfügbarkeit von Cu- und Ag-Ionen und die Ladungsumwandlung von Cu-Ionen.

Die Charakterisierung der in dieser Studie verwendeten NPs ist in Tabelle 1 dargestellt. CuO-NPs (CuO) und mit Aminogruppen funktionalisiertes CuO (CuO–NH2) hatten ein positives Zetapotential, mit Carboxylgruppen funktionalisiertes CuO (CuO–COOH) hatten ein negatives Zetapotential. Potenzial. Alle getesteten Ag-NPs hatten ein stark negatives Zetapotential im Bereich von –56,6 mV im Fall von beschichteten Silbernanopartikeln (cAg) bis –27,7 mV im Fall von Nanosilber (nAg). Im RPMI-Zellkulturmedium (RPMI CCM) war das Zetapotential der NPs für alle NPs negativ und reichte von –8,9 mV (CuO–NH2) bis –10,8 mV (CuO), was höchstwahrscheinlich auf die Adsorption der Serumproteine ​​zurückzuführen ist (sogenannte „Proteinkorona“, eine dynamische Tarnung, die aus der Anhaftung von Proteinen an der Oberfläche von NPs resultiert), wie zuvor von Ivask et al.24 vorgeschlagen. Daher gehen wir davon aus, dass die Proteinadsorption den Effekt der NP-Ladungen in allen nachfolgenden Experimenten zumindest teilweise maskierte. Die Auflösung unter den Ag-NPs war im Fall von Ag2O am höchsten und im Fall von nAg am niedrigsten.

Der synergistische Effekt wurde erstmals mit dem RPMI-Zellkultur-Testmedium charakterisiert, da es Blutserum mit Wachstumsfaktoren enthält, wodurch es dem Transsudat ähnelt, das bei einer Gewebeinfektion entsteht. Ein Beispiel für die synergistische antibakterielle Wirkung von NPs ist in Abb. 1 dargestellt. Um die synergistische Wirkung zu demonstrieren, verwendeten wir als Stellvertreter die minimale bakterizide Konzentration (MBC, die niedrigste getestete Konzentration, die kein sichtbares Bakterienwachstum auf agarisiertem Wachstumsmedium ergab). Während zur irreversiblen Inaktivierung von E. coli 40 mg/l Ag-NPs oder 400 mg/l CuO-NPs erforderlich waren, waren bei kombinierter Verwendung nur 5 mg/l Ag-NPs + 25 mg/l CuO-NPs erforderlich (Abb. 1).

Die antibakterielle Synergie zwischen CuSO4 und cAg. Die Escherichia coli K-12-Suspension wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen von entweder Ag-NPs, CuSO4 oder deren Kombinationen in RPMI-Zellkulturmedium 24 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurden 3 μl der Bakterien-NP-Mischung auf agarisierte Brühe pipettiert und die minimale bakterizide Konzentration (MBC, die niedrigste getestete Konzentration, die nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C im Dunkeln kein sichtbares Bakterienwachstum ergab) bestimmt. Auf den Achsen sind die Konzentrationen von cAg und CuSO4 dargestellt. Die minimale bakterizide Konzentration von CuSO4 und cAg betrug 400 mg/L bzw. 40 mg/L.

Um den synergistischen Effekt zwischen verschiedenen NPs und zwischen verschiedenen Bakterienstämmen zu quantifizieren und zu vergleichen, haben wir den Begriff „Koeffizient der antibakteriellen Synergie“, K(AbS), eingeführt, der die antibakterielle Wirksamkeit von NPs-Kombinationen (Mischung) im Vergleich zur Summe der MBC-Werte zeigt einzelner NPs berechnet und wie folgt berechnet (Gl. 1):

Gleichung (1) zeigt die Berechnung des antibakteriellen Synergiekoeffizienten (K(AbS) aus minimalen bakteriziden Konzentrationen (MBC).

Eine ähnliche Synergieberechnung wurde zuvor für Metallmischungen von Vaidya et al.16 veröffentlicht. K(AbS) > 1 markiert Synergie, K(AbS) = 1 markiert additive Wirkung oder K(AbS) < 1 markiert Antagonismus.

Abbildung 1 zeigt, dass der MBC der Mischung aus cAg- und CuO-NPs um ein Vielfaches niedriger ist als der MBC der einzelnen Komponenten. Nach der Formel von \({\text{K}}\left( {{\text{AbS}}} \right) = 1/\left( {\frac{{50\;{\text{mg}}/ {\text{L}}}}{{400\;{\text{mg}}/{\text{L}}}} + \frac{{2,5\;{\text{mg}}/{\text {L}}}}{{40\;{\text{mg}}/{\text{L}}}}} \right)\) = 1/(1/8 + 1/16) = 5,33. Somit war in diesem Beispiel die antibakterielle Wirkung der Mischung 5,33-mal höher als die Summe der antibakteriellen Wirkungen der einzelnen Komponenten.

Berechnungen für die Mischung aus 25 mg/L CuSO4 + 5 mg/L cAg ergeben den gleichen K(AbS). Allerdings ist K(AbS) in anderen Variationen des CuSO4/cAg-Verhältnisses niedriger (z. B. 200 mg/L CuSO4 + 1,5 mg/L cAg-Gemisch). Der Unterschied zwischen K(AbS) in Abhängigkeit vom Cu/Ag-Verhältnis ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Der höchste K(AbS) wurde meist bei einem Verhältnis von 1:1 bis 12,5:1 Cu/Ag beobachtet.

MBC-Werte verschiedener Cu-Komponenten allein und in der Mischung mit cAg in verschiedenen Bakterien sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. MBC für verschiedene Bakterien waren ähnlich, mit Ausnahme von P. aeruginosa, das gegen Cu-Verbindungen resistent war, obwohl cAg-MBC für P. aeruginosa vorhanden war ähnlich wie bei anderen Bakterien.

Das berechnete K(AbS) für verschiedene Bakterien ist in Abb. 2 dargestellt. Es wurde ein offensichtlicher antibakterieller synergistischer Effekt zwischen den meisten Cu-Verbindungen und Ag-NPs festgestellt (Abb. 2, Ergänzungstabelle 1).

Koeffizient der antibakteriellen Synergie zwischen cAg- und Kupferkomponenten in verschiedenen Bakterien im RPMI-Zellkulturmedium. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. cAg, beschichtete Silbernanopartikel; CuO Kupferoxid; CuO–NH2, mit Aminogruppen beschichtetes Kupferoxid; CuO–COOH, mit Carboxygruppen beschichtetes Kupferoxid; CuSO4, Kupfersulfat.

Unter den CuO-NPs wurde der höchste K(AbS)-Wert mit cAg bei nichtfunktionalisiertem CuO und insbesondere bei CuO-NH2 beobachtet, die beide positiv geladen sind. Der niedrigste K(AbS)-Wert wurde bei negativ geladenem CuO-COOH beobachtet und lag meist unter 2. Dies legt nahe, dass die ursprüngliche Ladung von CuO-NPs (die sich im Zeta-Potential in MQ-Wasser widerspiegelt) die antibakterielle Synergie beeinflusste. Interessanterweise war die Ladung der NPs im Zellkulturmedium aufgrund der Proteinkorona gleichmäßig (Tabelle 1). Dies lässt darauf schließen, dass einige unberührte NP-Oberflächen auch nach der Bildung der Proteinkorona im Zellkulturmedium verfügbar blieben.

Der höchste K(AbS) wurde für E. faecalis und E. coli (sowohl K-12 als auch ESBL) beobachtet. Es ist interessant festzustellen, dass E. coli ESBL im Vergleich zu E. coli K12 resistenter gegen Antibiotika ist und in dieser Studie auch resistenter gegen cAg war. Allerdings waren die K(AbS)-Werte bei diesen Bakterien ähnlich. Bei E. faecalis wurde bei allen Kombinationen ein hoher K(AbS)-Wert beobachtet, der auf eine schnellere DNA-Zerstörung durch Cu-Komponenten im Vergleich zu Enterobakterien (wie E. coli) zurückzuführen sein könnte25.

P. aeruginosa hatte von allen getesteten Bakterien den niedrigsten K(AbS)-Wert. Der Grund dafür könnte das leistungsstarke Antidrug-Efflux-System und die verringerte Durchlässigkeit der Außenmembran sein26.

Wir führten zusätzliche Studien mit verschiedenen Ag-NPs und AgNO3 durch, um festzustellen, welche davon eine stärkere antibakterielle Synergie mit den Cu-Komponenten aufweisen würden.

Ergänzende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von MBC in E. coli K-12 mit verschiedenen Ag- und Cu-Komponenten in der Mischung und allein. Die berechneten K(AbS) sind in Abb. 3 dargestellt.

Koeffizient der antibakteriellen Synergie (K(AbS)) zwischen verschiedenen Ag- und Cu-Komponenten in RPMI-Zellkulturmedien mit Escherichia coli K-12-Stamm. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, ##P < 0,01 Antagonismus. Hinweis: K(AbS) wurde als mittlerer K(AbS) aus verschiedenen Experimenten berechnet, nicht aus dem mittleren MBC der Komponenten in der Mischung oder allein. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung. cAg, beschichtete Silbernanopartikel; nAg, Nanosilber; Ag2O, Silberoxid; AgNO3, Silbernitrat; CuO, Kupferoxid; CuO–NH2, mit Aminogruppen beschichtetes Kupferoxid; CuO–COOH, mit Carboxygruppen beschichtetes Kupferoxid; CuSO4, Kupfersulfat.

Beim Mischen mit Cu-Komponenten zeigten die meisten Ag-NPs einen hohen K(AbS)-Wert. Im Gegensatz dazu zeigte AgNO3 keine starke antibakterielle Synergie mit Cu-Komponenten (Abb. 3, Ergänzungstabelle 2). Die höchsten K(AbS) wurden für drei Mischungen beobachtet: cAg mit CuSO4 und nAg mit CuSO4/CuO–NH2. Die Tatsache, dass CuSO4 und CuO–NH2 gut gelöst waren (Tabelle 1) und somit eine Quelle für Cu-Ionen waren, legt nahe, dass Cu-Ionen für die Synergie erforderlich sind. Das atypische K(AbS)-Ergebnis lag in der Mischung aus Ag2O und CuSO4 (keine Synergie). Im Gegensatz zu cAg und nAg waren Ag2O-NPs stärker oxidiert (aufgelöst). Diese Daten weisen stark darauf hin, dass sowohl nicht oxidierte Ag-NPs als auch Cu-Ionen erforderlich sind, um die starke antibakterielle synergistische Wirkung zu erzielen.

Als nächstes untersuchten wir, ob das Kultivierungsmedium einen Einfluss auf die antibakterielle Synergie hatte. MBC von cAg, CuSO4 und ihren Mischungen in verschiedenen Medien ist in der Ergänzungstabelle 3 und K(AbS) in Abb. 4 dargestellt. Im Bakterienwachstumsmedium mit hohem Gehalt an Proteinen und Nährstoffen war K(AbS) höher. Der höchste K(AbS)-Wert lag im LB-Medium und der niedrigste im MQ-Medium (Abb. 4). Wichtig ist, dass das Bakterienwachstum auch bei LB am schnellsten war (ergänzende Abbildung 2). Dies deutet darauf hin, dass die Synergie bei Zellen in der aktiven und sich teilenden Phase stärker ausgeprägt ist. Höchstwahrscheinlich haben die NPs und die von den NPs freigesetzten Metallionen bei aktivem Bakterienwachstum einen besseren Zugang zum intrazellulären Raum, um die DNA27 zu zerstören und Proteine ​​zu schädigen. Interessanterweise inaktivieren auch herkömmliche Antibiotika Bakterien in der Nichtwachstumsphase weniger wirksam, insbesondere S. aureus28.

Koeffizient der antibakteriellen Synergie in verschiedenen Medien. Koeffizient der antibakteriellen Synergie in der Mischung aus beschichteten Silbernanopartikeln und Kupfersulfat in verschiedenen Wachstumsmedien gegen den Escherichia coli K-12-Stamm. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen. MQ MilliQ Wasser, RPMI.

Mehrere zusätzliche Tests wurden durchgeführt, um die Mechanismen der antibakteriellen Synergie zwischen Cu und Ag zu verstehen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die antibakterielle Synergie eine Funktion der unterschiedlichen Wirkungsweisen von Cu und Ag ist. Das Zusammenspiel von Beta-Lactam-Antibiotika, die die Zellmembran von Bakterien schädigen, und Aminoglykosiden, die die Proteinsynthese in Bakterien hemmen, ist ein bekanntes Beispiel für die klassische Synergie von Antibiotika. Die Synergie zwischen Aminoglykosiden und β-Lactamen wurde auf eine durch β-Lactam vermittelte Membranschädigung zurückgeführt, die zu einer erhöhten Aufnahme von Aminoglykosiden führt29.

Eine Hypothese war, dass eine der Komponenten (Cu- oder Ag-NPs) die Membran stärker schädigt, wodurch eine andere Komponente leichter in die Zelle eindringen und die inneren Strukturen schädigen kann. Als Positivkontrolle wurde in diesem Experiment Polymyxin B verwendet, das die äußeren Bakterienmembranen gramnegativer Zellen30 zerstört. Um die Hypothese zu überprüfen, wurde die Permeabilität der Außenmembran von zwei gramnegativen Bakterien, E. coli K-12 und Pseudomonas aeruginosa PAO1, gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass AgNO3 und cAg die äußere Membran beider Bakterien schädigten (Abb. 5a,b). cAg benötigte im Vergleich zu AgNO3 mehr Zeit, um die Membran zu schädigen, und die Membran von P.aeruginosa benötigte im Vergleich zu E. coli mehr Zeit, um geschädigt zu werden. CuO-NPs und CuSO4 verursachten keine nennenswerten Membranschäden, insbesondere bei P. aeruginosa. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine Möglichkeit zur Inaktivierung von Zellen im Fall von Ag-Verbindungen darin besteht, die äußeren Membranen der Bakterien zu zerstören, wohingegen Cu-Verbindungen auf andere Zellstrukturen einwirken (sogar hohe Cu-Konzentrationen, die innerhalb von 24 Stunden zum Zelltod führen). nicht zu einer schnellen Zerstörung der äußeren Membran führen). Die Membranzerstörung durch Ag könnte Cu dabei helfen, diese inneren Zellstrukturen im Fall einer Ag- und Cu-Mischung zu erreichen. Basierend auf diesen Daten beschlossen wir, diese Hypothese durch Mischen von Cu- und Ag-Verbindungen zu testen. Außerdem wurde ein Test mit einer Mischung aus Cu-Verbindungen und cAg durchgeführt. Die schädigende Wirkung von cAg auf die Membran wurde durch die Zugabe von CuSO4 oder Cu-NH2 nicht beeinträchtigt (Abb. 5c, d). Es wurden auch Tests mit der Zugabe von CuO-COOH oder CuO zu cAg durchgeführt, und die zusätzliche zerstörende Wirkung auf die Membran wurde nicht festgestellt (nicht gezeigt), ebenso wie mit der Zugabe von CuSO4 oder Cu-NH2. Auch die Zugabe von Cu-Komponenten zu Polymyxin B, die die äußere Membran schnell schädigt, verstärkte die Wirkung von Polymyxin B auf die Membran nicht (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus wurde der antibakterielle synergistische Effekt zwischen CuSO4 und Polymyxin B in E. coli K-12 im MBC-Test nicht nachgewiesen (K(AbS) = 1,054 ± 0,243, Daten nicht gezeigt). Wir kamen daher zu dem Schluss, dass Ag und Cu unterschiedlich auf die bakterielle Außenmembran wirken, ihre Wirkung auf die Außenmembran jedoch nicht die Hauptursache für die antibakterielle Synergie ist.

Schädigung der äußeren Bakterienmembran durch Ag- und Cu-Verbindungen oder deren Kombination. Der Anstieg der Fluoreszenz weist auf eine Schädigung der äußeren Membran von Escherichia coli (a, c) und Pseudomonas aeruginosa (b, d) nach 30-minütiger Inkubation mit den Komponenten allein (a, b) und in den Mischungen mit cAg (c, d) hin. . Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung. cAg, beschichtete Silbernanopartikel; AgNO3, Silbernitrat; CuO, Kupferoxid; CuO–NH2, mit Aminogruppen beschichtetes Kupferoxid; CuO–COOH, mit Carboxygruppen beschichtetes Kupferoxid; CuSO4, Kupfersulfat; PB, Polymyxin B.

Die Möglichkeit, dass Cu-Ionen einen Redoxzyklus zwischen Cu+/Cu++ durchlaufen, ist als Fenton-ähnliche Reaktion bekannt und kann reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugen, die zu Lipidperoxidation, Proteinoxidation und DNA-Schäden führen31. Als nächstes stellten wir die Hypothese auf, dass eine verstärkte Produktion von ROS der Grund für die Synergie zwischen Cu- und Ag-Komponenten sein könnte. Tatsächlich wurde zuvor gezeigt, dass CuO-NPs13 und Ag-NPs32 ROS induzieren. Wir haben zuvor auch gezeigt, dass CuO–NH2 im Vergleich zu nicht funktionalisiertem CuO und CuO–COOH13 mehr ROS induziert.

Die ROS-Erzeugung wurde in dieser Studie sowohl unter biotischen (in Anwesenheit von Bakterien) als auch unter abiotischen (ohne Bakterien) Bedingungen bestimmt (Abb. 6). Die höchsten ROS-Werte wurden in einzelnen cAg- und CuO-NH2-Suspensionen nachgewiesen (Abb. 6a, b). cAg induzierte die höchsten ROS-Werte unter abiotischen Bedingungen (Abb. 6a), während CuO-NH2 unter biotischen Bedingungen (Abb. 6b) induzierte. Bei CuSO4 und AgNO3 wurden keine ROS nachgewiesen.

Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Suspensionen. Messung der Induktion von ROS unter abiotischen (a, c) und biotischen (b, d) Bedingungen. Die Messung der ROS-Induktion wurde nach Inkubation mit Komponenten allein (a, b) oder in der Mischung aus cAg- und Cu-Komponenten im Verhältnis 1:4 (c, d) durchgeführt. cAg, beschichtete Silbernanopartikel; AgNO3, Silbernitrat; CuO, Kupferoxid; CuO–NH2, mit Aminogruppen beschichtetes Kupferoxid; CuSO4, Kupfersulfat; RFU, relative Fluoreszenzeinheiten.

ROS in der Mischung aus cAg- und Cu-Komponenten (im Verhältnis 1:4) wurden getestet, um die Hypothese zu überprüfen, dass das cAg nach der Zugabe von CuSO4 oder CuO-NH2 mehr ROS produziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zugabe von CuO-NH2 oder CuSO4 zu cAg die ROS-Produktion weder unter biotischen noch unter abiotischen Bedingungen steigerte (Abb. 6c, d). Darüber hinaus wurde ein Antagonismus festgestellt (z. B. niedrigere ROS in der Mischung aus cAg- und Cu-Komponenten im Vergleich zu cAg allein), was darauf hindeutet, dass ROS nicht die Ursache für die antibakterielle Synergie war.

Da die Toxizität von NPs auf Metallbasis hauptsächlich durch deren Ionen verursacht wird, haben wir beschlossen, intrazelluläre Cu- und Ag-Ionen zu messen. Dazu verwendeten wir den biolumineszierenden Biosensor E. coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux, der als Reaktion auf intrazelluläres Cu und Ag34 Luciferase produziert. In diesem Bakterium induzieren intrazelluläre Ag- und Cu-Ionen dosisabhängig die Lumineszenz von Bakterien.

Da die Biosensorbakterien nicht selektiv sind und sowohl Ag- als auch Cu-Ionen erkennen, war es nicht möglich, intrazelluläres Ag und Cu einzeln zu bestimmen. Daher haben wir die relativen Werte und den Koeffizienten der induktiven Synergie K(InS) verwendet. K(InS) wurde auf die gleiche Weise wie der antibakterielle Synergiekoeffizient berechnet. K(InS) ist der Kehrwert der Summe der Verhältnisse der Biolumineszenz (LC)-Spitzenkonzentrationen der Komponenten in der Mischung zu den LC-Spitzenkonzentrationen allein (Gleichung 2).

Gleichung (2) zeigt die Berechnung des Koeffizienten der induktiven Synergie (K(InS)) aus den Spitzenkonzentrationen der Biolumineszenz (LC) (Konz.).

Zunächst wurde die Biolumineszenz von Bakterien mit einzelnen Ag- und Cu-Komponenten gemessen (Abb. 7a). Anschließend mischten wir Cu-Komponenten mit cAg und stellten eine deutliche Verschiebung des LC-Peaks nach links fest (Abb. 7b), jedoch keine Verschiebung beim Mischen mit AgNO3 (Abb. 7c). Die maximalen LC-Konzentrationen der Komponenten einzeln und in der Mischung sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt.

Lumineszenz von Biosensorbakterien als Reaktion auf Komponenten. Lumineszenz (LC) von Escherichia coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux als Reaktion auf 4-stündige Inkubation mit Komponenten allein (a). Die signifikante Verschiebung des LC-Peaks nach links in der Mischung aus Kupferkomponenten mit cAg im Vergleich zu cAg allein (b). Keine Verschiebung des Peak-LC in der Mischung von Kupferkomponenten mit AgNO3 im Vergleich zu AgNO3 allein (c). Repräsentative Zahlen stammen aus drei unabhängigen Experimenten. cAg, beschichtete Silbernanopartikel; AgNO3, Silbernitrat; CuO, Kupferoxid; CuO–NH2, mit Aminogruppen beschichtetes Kupferoxid; CuO–COOH, mit Carboxygruppen beschichtetes Kupferoxid; CuSO4, Kupfersulfat.

Die hohe Induktion von Biolumineszenz als Reaktion auf die intrazelluläre Konzentration von Cu- und Ag-Ionen wurde in den Mischungen von Cu-Komponenten mit cAg beobachtet (Abb. 7b). Zur Reaktionsinduktion waren geringere Konzentrationen an cAg- und Cu-Komponenten in den Mischungen erforderlich. In Kombination von Cu-Komponenten mit cAg zeigten alle getesteten Mischungen einen hohen K(InS), nicht jedoch in den Mischungen von Cu-Komponenten und AgNO3 (Abb. 8). Die Tatsache, dass K(InS) bei den Mischungen aus cAg- und Cu-Komponenten deutlich über 1 lag, zeigte, dass Biosensorbakterien höhere intrazelluläre Konzentrationen von Metallionen in der Mischung aus cAg- und Cu-Komponenten wahrnahmen als in der Summe der einzelnen Komponenten. Dies wurde nicht auf die durch cAg verursachte Membranschädigung und den besseren Zugang von Cu zu den inneren Komponenten der Zellen zurückgeführt (Abb. 5c, d). Es kann davon ausgegangen werden, dass die intrazelluläre Konzentration von Ag in Kombination mit CuSO4 aufgrund der besseren Auflösung von cAg in Gegenwart von Cu2+ höher war. Außerdem ist die Auflösung von AgNO3 sehr hoch und kann durch Cu-Ionen nicht verstärkt werden, weshalb wir keinen synergistischen Effekt zwischen Cu-Komponenten und AgNO3 beobachten konnten.

Koeffizient der induktiven Synergie in einer Mischung aus Cu- und Ag-Komponenten. Die Induktion der Biolumineszenz in Bakterien war als Reaktion auf die Mischung aus cAg- und Cu-Komponenten höher als bei Komponenten allein. Diese verstärkte Reaktion wurde in der Mischung aus AgNO3- und CuO-NPs nicht nachgewiesen. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, ##Antagonismus P < 0,01. cAg, beschichtete Silbernanopartikel; AgNO3, Silbernitrat; CuO, Kupferoxid; CuO–NH2, mit Aminogruppen beschichtetes Kupferoxid; CuO–COOH, mit Carboxygruppen beschichtetes Kupferoxid; CuSO4, Kupfersulfat.

Als nächstes untersuchten wir die Auflösung von Ag-NPs in Wasser und RPMI CCM unter zwei verschiedenen Bedingungen: mit und ohne Zugabe von CuSO4. Wir fanden einen signifikanten Unterschied zwischen der Auflösung von Ag-NPs mit und ohne CuSO4-Zugabe (Abb. 9). In MQ-Wasser betrug der Unterschied der nAg- und Ag2O-Auflösung mehr als das Vierfache bzw. das Zweifache nach der CuSO4-Zugabe. Während bei RPMI CCM der Unterschied in der nAg-Auflösung nach der CuSO4-Zugabe mehr als 16-fach betrug (Abb. 9). Wir gehen davon aus, dass die Mischung aus nAg und CuSO4 im Wasser die Auflösung von Ag-NPs durch die folgende Gleichung verbessert. 3:

Auflösung von Silbernanopartikeln. Auflösungsprozentsatz der Silberkomponenten (100 mg/L) in Wasser und in RPMI CCM mit und ohne Zugabe von CuSO4 (400 mg/L) nach 24-stündiger Inkubation im Schüttler bei 37 °C. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. cAg, beschichtete Silbernanopartikel; nAg, Nanosilber; Ag2O, Silberoxid; AgNO3, Silbernitrat; CuSO4, Kupfersulfat; RPMI CCM, Zellkulturmedien des Roswell Park Memorial Institute.

Gleichung (3) zeigt die Redoxreaktion zwischen Kupfer- und Silberkomponenten.

Bei RPMI wird die Reaktion höchstwahrscheinlich durch organische Verbindungen beeinflusst. Beispielsweise könnte die Auflösung von AgNO3 in serumhaltigem RPMI CCM 100 % betragen, aber die meisten freien Ag+-Ionen werden von Serumproteinen komplexiert35. Da Cu-Ionen die Bindung von Ag-Ionen an Serumproteine ​​verhindern, gab es einen signifikanten Unterschied in der Konzentration freier Ag-Ionen in einer Lösung von AgNO3 in RPMI CCM mit und ohne CuSO4. Beide Effekte sind in einer Suspension von nAg und CuSO4 in RPMI CCM vorhanden und führen zu einem 16-fachen Anstieg der Menge an freien Ag-Ionen in einer CuSO4-haltigen Probe im Vergleich zu einer CuSO4-freien Probe (Abb. 9). Außerdem hatte bereits oxidiertes Ag2O, wie bereits beschrieben, in RPMI CCM mit CuSO4 keine antibakterielle Synergie und wir konnten nach der Zugabe von CuSO4 keine bessere Auflösung von Ag2O in diesem Lösungsmittel beobachten (Abb. 9).

Wie im vorherigen Abschnitt erwähnt (Gleichung 3), entsteht Cu+ in der Mischung aus Ag-NPs und Cu2+-Ionen. Um das Vorhandensein von Cu+ in der Mischung nachzuweisen, wurde eine qualitative chemische Reaktion durchgeführt, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. In einer Mischung von Komponenten bewies die qualitative Reaktion das Vorhandensein von Cu+, jedoch nicht in nAg-Suspension, AgNO3 oder CuSO4-Lösungen separat. Diese Untersuchung zeigte, dass sich das Gleichgewicht wie erwartet einstellte. Außerdem wurde zuvor gezeigt, dass Cu+ im Vergleich zu Cu2+36,37 eine stärkere antibakterielle Wirkung hat, da Cu+ in der Lage ist, in Gegenwart von Superoxid in einer Reaktion analog zur Fenton-ähnlichen Reaktion OH-Radikale zu erzeugen38. Daher könnte die Bildung zusätzlicher Cu+-Ionen in der Lösung einer der Hauptfaktoren sein, die die antibakterielle Synergie des Ag NP/Cu2+-Systems beeinflussen.

Im Allgemeinen kommt es zu Synergien, wenn Komponenten unterschiedliche Wirkmechanismen haben. Obwohl die antibakterielle Synergie zwischen Ag- und Cu-Komponenten (hauptsächlich Metalle und keine NPs) bereits beschrieben wurde, wurden die Mechanismen der Synergie nicht untersucht. Frühere Veröffentlichungen deuteten auf einige Mechanismen der antibakteriellen Synergie hin, während die Autoren hauptsächlich die Hypothese aufstellten, dass Ag auf die bakterielle Plasmamembran abzielt, während Cu Nukleinsäuren und andere interne Biomoleküle und Zellstrukturen denaturiert15,16,19,22. Im Gegensatz dazu beobachteten wir in unserer Studie keine bemerkenswerte Synergie zwischen Cu-Komponenten und AgNO3 (Abb. 2) oder Polymyxin B, die beide bemerkenswerte Membranschäden verursachten (Abb. 5).

Außerdem wurde vorgeschlagen, dass aus CuO-Legierungen freigesetzte Cu-Ionen Bakterien inaktivieren, indem sie die ROS-Produktion steigern, was zu DNA-Schäden und Lipidperoxidation führt16,19,22. Darüber hinaus produzierten auf CuO und Cu(OH)2 verankerte Ag-NPs ROS in größeren Mengen als CuO39, aber in diesem Fall könnte die ROS-Produktion aufgrund von Cu(OH)2 gesteigert werden. Unter biotischen oder abiotischen Bedingungen beobachteten wir jedoch keine signifikante ROS-Produktion in CuSO4-Lösung, wohingegen die ROS-Produktion durch cAg deutlich höher war. Im Gegenteil, die Zugabe von CuSO4 verringerte die Menge der ROS-Produktion in der cAg-Suspension unter biotischen und abiotischen Bedingungen (Abb. 6).

Jang und al. (2020) zeigten, dass die Freisetzung von Ag+-Ionen aus NP in der Lösung mit der höheren Konzentration an Cu2+-Ionen deutlich höher war23. Außerdem hing die höhere Freisetzung von Ag+ mit der höheren Temperatur und der längeren Zeit der NP-Inkubation zusammen21. Dieser Synergiemechanismus steht im Einklang mit den Ergebnissen unserer Studie.

Unsere Forschung hat gezeigt, dass eine Kombination aus nicht oxidierten Ag-NPs und Cu-Ionen für die synergistische antibakterielle Wirkung wesentlich ist. Die antibakterielle Synergie zwischen Ag-NPs und Cu-Komponenten hat unserer Studie zufolge mindestens drei Gründe. Erstens erleichtern Cu-Ionen die Oxidation von nicht oxidiertem Ag0 (Gl. 3) in einer Redoxreaktion und dadurch eine bessere Auflösung von Ag+ aus Ag-NPs in Lösungsmitteln in Gegenwart von Cu2+ (Abb. 9). Tatsächlich wird nicht oxidiertes Ag0 in NPs für die Redoxreaktion mit Cu2+ zur Bildung von Ag+ und Cu+ benötigt. Eine bessere Auflösung von Ag-NPs führt zu einer höheren Konzentration von Ag+ im Lösungsmittel und intrazellulär in Bakterien (Abb. 7), was zu einer stärkeren antibakteriellen Wirkung führt. Der zweite Grund ist die Produktion von Cu+-Ionen in derselben Redoxreaktion (Gleichung 3). Cu+-Ionen sind im Vergleich zu Cu2+38 antibakterieller. Der dritte Grund besteht darin, dass freie Ag-Ionen in Gegenwart von Cu2+ weniger effektiv an Proteine ​​im Kulturmedium binden, was zu einer höheren Konzentration an freiem Ag+ in der Lösung führt (Abb. 9). Daher ist für die synergistische Wirkung die Freisetzung von Cu2+-Ionen aus CuO-NPs erforderlich. Alle beschriebenen Prozesse können sowohl extrazellulär als auch intrazellulär ablaufen, wobei letzterer für die Zellhomöostase schädlicher ist. Darüber hinaus könnten andere Faktoren wie das Zetapotential und die NP-Oberflächenfunktionalisierung geringfügige Auswirkungen auf die antibakterielle Synergie haben, aber um dies zu beweisen, sind weitere Studien erforderlich.

Ag und Cu werden seit der Antike getrennt als antibakterielle Wirkstoffe verwendet. Unsere Studie zeigte, dass die antibakterielle Wirkung der NP-Mischung mit Ag- und Cu-Komponenten bis zu sechsmal höher war als die Summe der antibakteriellen Wirkungen der einzelnen Komponenten. Die Mechanismen der Synergie sind: bessere Auflösung von Ag in Gegenwart von Cu-Ionen aufgrund der Oxidation in der Redoxreaktion, die Produktion von mehr antibakteriellen Cu+-Ionen während derselben Redoxreaktion und eine ungünstigere Bindung von Ag-Ionen an mittlere Proteine ​​in der Gegenwart von Cu-Ionen. Die antibakterielle Synergie zwischen Ag und Cu könnte eine ideale Lösung für einige medizinische Probleme sein, bei denen die Beseitigung von Infektionen erforderlich ist und bei denen die antibakterielle Wirkung von Ag oder Cu allein nicht ausreicht. Die Ergebnisse der Studie können beispielsweise zur Entwicklung kombinatorischer Nanotechnologie für den Einsatz in antibakteriellen Wundauflagen zur Behandlung infizierter Wunden genutzt werden. Da die Behandlung einiger bakterieller Wundinfektionen ein ungelöstes Problem darstellt, könnte eine kombinatorische Behandlung von Wunden auf Basis von Cu- und Ag-NPs Wundinfektionskomplikationen (wie infektionsbedingte Gangrän und Amputationen) reduzieren und die qualitätsadjustierten Lebensjahre (QALY) erhöhen Patienten.

Alle Chemikalien hatten mindestens analytische Qualität. Polymyxin B und NaCl wurden von Sigma-Aldrich Co. (USA) bezogen; AgNO3 von JT Baker (USA), CuSO4 von Alfa Aesar Gmbh & Co. (Deutschland); 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat von Life Technologies (USA); phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Biognost (Kroatien); Trypton, Hefeextrakt und Agar von LabM (UK); RPMI 1640 mit Glutamin und Natriumpyruvat von Corning (USA); Fetales Rinderserum von Gibco (USA).

Drei Arten funktionalisierter und nicht funktionalisierter CuO-NPs wurden von PlasmaChem GmbH (Deutschland) erhalten. CuO-NPs wurden von PlasmaChem durch Zersetzung von Cu2CO3(OH)2 synthetisiert, gefolgt von der Einführung der Oberflächengruppen durch Behandlung mit Mercaptopropionsäure. Beschichtete Ag-NPs (cAg) wurden von Laboratorios Argenol SL (Spanien) erhalten, unbeschichtete Ag-NPs (nAg) von Sigma-Aldrich (USA). Ag2O-NPs (Ag2O) wurden von uns wie unten beschrieben synthetisiert.

Kommerzielle NPs wurden als trockene Pulver bereitgestellt und die Suspensionen wurden jedes Mal vor den Tests frisch in Konzentrationen von 2000 mg Verbindung/l in endotoxinfreiem Milli-Q®-Wasser (MQ) zubereitet. Zehn Milliliter CuO-NP-Suspensionen wurden verwirbelt und unter Verwendung einer Sondenbeschallung (Branson 450 Sonifier, USA) 5 Minuten lang mit einer akustischen Leistung von 13 W beschallt, was einer spezifischen Energie von 3,9·105 kJ/m340 entspricht.

Die Morphologie und Primärgröße aller NPs außer Ag2O wurden in unseren früheren Studien8,13,41 charakterisiert.

Die Charakterisierung von Ag2O-NPs mittels Röntgenkristallographie und Transmissionselektronenmikroskopie wurde an der Universität Tartu durchgeführt. Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Messungen (STEM) wurden mit dem Cs-korrigierten FEI Titan Themis 200-Instrument durchgeführt. Die Proben wurden in Isopropylalkohol vorbereitet, mit Ultraschall behandelt und auf mit Kohlenstofffilm bedeckten TEM-Gittern abgeschieden. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurden die Proben gleichzeitig mit Hellfeld- (BF) und Hochwinkel-Dunkelfelddetektoren (HAADF) gemessen.

Hydrodynamische Größe (Dh), Polydispersitätsindex (PDI) und Zeta-Potenzial (Zeta-Potenzial) von NPs wurden in 100 mg/l Suspensionen in MQ-Wasser oder in Zellkulturmedium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mit 10 % FBS und 1 gemessen % Natriumpyruvat (RPMI CCM) unter Verwendung von Malvern Zetasizer (Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instruments, UK).

Der Metallgehalt der getesteten Verbindungen wurde mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) (contrAA 800, Analytik Jena Ag) bestimmt. Materialien und Nanopartikel wurden in 1 ml konzentrierter HNO3 (Nitric Acid TraceMetal Grade 67–69 %, Seastar Chemicals) 24 Stunden lang bei 65 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Suspension gevortext und 1:1000 in 1 % HNO3 verdünnt. Das Gewebe und das Blutserum wurden in H2O2 (Perdrogen 30 %, Sigma-Aldrich) und konzentrierter HNO3 im folgenden Verhältnis 1:1:8 (Gewebe: H2O2: HNO3) inkubiert und 24 Stunden lang bei 65 °C inkubiert Die Suspension wurde 10-fach in 1 % HNO3 verdünnt und mittels AAS analysiert. Die Messungen wurden dreifach in mindestens zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt.

Analytisches Silbernitrat (wasserfrei, mit einer Reinheit über 99,9 %) (5 mmol, 0,85 g) wurde in 50 ml entionisiertem Wasser gelöst und 1 Minute lang mit Ultraschall behandelt, um bei Raumtemperatur eine homogene Lösung zu erhalten.

Nachdem das Silbernitrat vollständig aufgelöst war, wurde Natriumhydroxid (10 mmol, 0,39 g) bei Umgebungsbedingungen schnell zur Reaktionsmischung gegeben und 2 Stunden lang mit Ultraschall behandelt.

Die endgültige Lösung wurde abgekühlt. Anschließend wurde der erhaltene schwärzliche Niederschlag auf Whatman-Filterpapier (Grade 5) filtriert und zweimal mit 50 ml MQ-Wasser abgeschreckt. Der schwarze Rückstand wurde dann 12 Stunden lang bei 70 °C getrocknet, was eine Ausbeute von über 60 % ergab.

Escherichia coli MG1655 K-12 (E. coli K-12) (erhalten vom E. coli Genetic Stock Center, Yale University), Escherichia coli ESBL (isoliert aus dem Urin eines 72-jährigen männlichen Patienten mit chronischer Prostatitis in West-Tallinn Central). Krankenhaus), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (erhalten von Prof. Patrick Plesiat, Besanc, Frankreich), Streptococcus dysgalactiae DSM 23.147 (erhalten von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen des Leibniz-Instituts, Braunschweig, Deutschland), rekombinanter biolumineszierender E. coli MC1061 (pSLcueR /pDNPcopAlux, zuvor in unserem Labor von Ivask et al.34 konstruiert), Enterococcus faecalis ATCC 29.212 (erhalten vom West-Tallinn Central Hospital) und Staphylococcus aureus ATCC 25.923 (erhalten vom West-Tallinn Central Hospital) wurden auf agarisiertem Luria gelagert –Bertani-Medium (LB, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, 1,5 % Agar) und vor den Tests in 3 ml RPMI bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min über Nacht kultiviert. Nach der Kultivierung über Nacht wurden 400 µl Inokulum mit 20 ml RPMI CCM gemischt und 4 Stunden lang inkubiert und bis zur exponentiellen Phase gezüchtet. Nach der Inkubation wurde die optische Dichte der Bakteriensuspension bei 620 nm (OD620) gemessen und die Suspension mit der gewünschten OD620 hergestellt. Im Fall rekombinanter Bakterien wurde RPMI CCM mit 100 µg/l Ampicillin und 10 µg/l Tetracyclin ergänzt, um das Biolumineszenz-kodierende Plasmid zu erhalten.

MBC wurde anhand der niedrigsten Konzentration, die 99,9 % der anfänglichen Bakterienpopulation abtötet, mithilfe des von Suppi et al.42 beschriebenen Spottests bestimmt. Nach Kultivierung über Nacht und 4-stündiger Inkubation bis zur Exponentialphase, wie zuvor beschrieben, wurde die Bakteriensuspension mit OD620 0,07 (entspricht 2 × 108 Zellen/ml43) in MQ, RPMI CCM oder LB erhalten. 100 μl Bakteriensuspension wurden zu 100 μl Komponenten allein oder deren Mischung im Medium gegeben. Bakterien wurden in RPMI CCM, LB oder MQ auf 96-Well-Mikrotiterplatten (BD Falcon) 24 Stunden lang bei 30 °C ohne Schütteln im Dunkeln exponiert. 3 µl der inkubierten Suspension wurden auf agarisiertes LB-Medium pipettiert und die Lebensfähigkeit der Bakterienzellen (Kolonienbildung) nach 24-stündiger Inkubation visuell beurteilt. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt.

Die Bakterien wurden für den Test vorbereitet, wie im Abschnitt „Bewertung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBC)“ beschrieben. Bakteriensuspension mit OD620 0,03 in MQ, RPMI CCM oder LB wurde 3 Stunden lang bei 37 °C in einem Schüttler inkubiert und die Bakteriendichte bei OD620 gemessen.

Die Zellwandpermeabilisierung von E. coli und P. aeruginosa durch AgNO3, cAg, CuO, CuO–COOH, CuO–NH2, CuSO4 und Polymixin B (PB, Positivkontrolle) wurde anhand der zellulären Aufnahme von N-Phenylnaphthalin-1- untersucht. Amin (1-NPN), im Wesentlichen wie von Helander und Mattila-Sandholm44 beschrieben. Anders als in einer hydrophilen Umgebung ist die Fluoreszenz von 1-NPN in einer hydrophoben Umgebung (z. B. Membran-Lipiddoppelschicht) deutlich verstärkt, was es zu einem geeigneten Farbstoff macht, um die Integrität der äußeren Membran (OM) von gramnegativen Bakterien zu untersuchen. Kurz gesagt, 50 µL 40 µM 1-NPN und 50 µL der getesteten Verbindung in 50 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), eingestellt mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS)-Base auf pH 7,2 (MOPS-TRIS). Puffer) wurden in die Vertiefungen schwarzer Mikrotiterplatten pipettiert. 100 µL Bakteriensuspension in 50 mM MOPS-TRIS-Puffer mit OD = 0,5 wurden in jede Vertiefung gegeben und die Fluoreszenz nach 30-minütiger Inkubation bei RT gemessen (Fluoroskan Ascent FL Plattenluminometer; Anregungs-/Emissionsfilter 350/460 nm). Der 1-NPN-Zellaufnahmefaktor wurde berechnet und als Verhältnis zwischen der Intensität der Fluoreszenzwerte der mit und ohne Testverbindungen inkubierten Bakteriensuspension dargestellt. Mindestens drei unabhängige Experimente wurden in technischen Duplikaten durchgeführt.

Die Induktion der Lumineszenz in Bakterien durch intrazelluläre Ag- und Cu-Ionen wurde unter Verwendung des rekombinanten Biosensorbakteriums Escherichia coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) durchgeführt. Die Reaktion rekombinanter E. coli auf intrazelluläre Ag- und Cu-Ionen wird über das CueR-Aktivatorprotein und seinen regulierten copA-Promotor vermittelt, der mit den Biolumineszenz-kodierenden Genen fusioniert ist34. Daher führt das Vorhandensein intrazellulärer Ag- und Cu-Ionen im subtoxischen Bereich dosisabhängig zu einem Anstieg der Biolumineszenz dieser rekombinanten Bakterien.

Die Vorbereitung der Testbakterien und das Verfahren des Biosensor-Assays waren analog zum Bakterienwachstumshemmungs-Assay mit einer Ausnahme: Das Wachstumsmedium des biolumineszierenden Ag-Biosensors E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) wurde mit 100 µg/l Ampicillin und ergänzt 10 µg/l Tetracyclin während der Übernachtkultivierung zur Erhaltung der rekombinanten Plasmide. Für die Biolumineszenzmessung (BL) wurde das Plattenluminometer Orion II (Berthold Detection Systems) verwendet. 100 µl Bakteriensuspension mit OD620 0,1 wurden 4 Stunden lang bei 30 °C Komponenten oder deren Mischung in RPMI CCM (Probe) oder RPMI CCM (Hintergrund) ausgesetzt. Dosis-Wirkungs-Kurven des Ag- und Cu-Biosensors wurden durch Auftragen der angewendeten Konzentrationen von Cu und Ag gegen die Biolumineszenz des Ag/Cu-Biosensors (als fache Induktion) in den jeweiligen Proben erhalten. Die Konzentration mit dem höchsten Biolumineszenzwert jeder Komponente wurde als LC-Peak markiert. Die Falteninduktion wurde wie folgt berechnet:

Dabei ist BLsample die Biolumineszenz des Ag/Cu-Biosensors in der Probe und BLbackground die Hintergrundbiolumineszenz unter Berücksichtigung der Verdunkelung der Lumineszenz aufgrund von NPs.

Da das Vorhandensein von Zellen die Bildung und Neutralisierung von ROS beeinflussen kann, wurde ROS sowohl unter biotischen (in Anwesenheit von Zellen) als auch unter abiotischen (ohne Zellen) Bedingungen quantifiziert.

Um die zelluläre (biotische) ROS-Produktion zu untersuchen, wurde frische Stammlösung von 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (H2DCFDA) in Ethanol auf eine Konzentration von 0,6 mg/ml gelöst und anschließend in 0,1 M Natriumphosphatpuffer verdünnt. 100 µL der Komponente in MQ-Wasser wurden in die Vertiefungen pipettiert. Dann wurden 100 µL Bakterienkultur (E. coli K-12 bei OD620 = 0,1) in MQ-Wasser hinzugefügt. Die Testplatten wurden 4 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 μl der Mischung in schwarze, nicht transparente 96-Well-Platten aliquotiert und H2DCFDA wurde den Zellen in einer Endkonzentration von 1,5 μg/ml zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation wurde die Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen (Anregung/Emission bei 485/527 nm). Im Assay diffundiert H2DCFDA durch die Zellmembran und wird von intrazellulären Esterasen zu einem nicht fluoreszierenden Dichlorfluorescin (DCFH) verarbeitet. DCFH wird dann aufgrund der Anwesenheit intrazellulärer ROS in das stark fluoreszierende 2′,7′-Dichlorfluorescein (DCF) umgewandelt.

Um ROS unter abiotischen Bedingungen zu untersuchen, wurde die Acetatgruppe von H2DCFDA 30 Minuten lang bei RT mit 0,01 M NaOH gespalten. Der Farbstoff wurde mit 0,1 M Na-Phosphat-Puffer auf eine Konzentration von 24 µg/ml verdünnt und dann in jede Vertiefung der schwarzen, nicht transparenten Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, um eine endgültige Farbstoffkonzentration von 12 µg/ml zu ergeben. Die Ergebnisse wurden durch den Leerwert dividiert und als relative Lichteinheiten (RFUs) dargestellt.

Für die Auflösungsanalyse wurden 100 mg/l cAg, Ag2O, nAg, AgNO3, CuSO4 (eine Wiederfindungskontrolle) in MQ-Wasser oder in RPMI CCM bei 37 °C für 24 Stunden inkubiert und anschließend bei 320.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert ( Beckman Coulter Ultrazentrifuge). Nach der Zentrifugation wurden die Überstände gesammelt und die Silberkonzentration mittels AAS (contrAA 800, Analytik Jena Ag) analysiert. Der Prozentsatz der NP-Auflösung wurde anhand der Silberkonzentration im Überstand nach der Zentrifugation berechnet, 100 mg/l wurden als 100 % angenommen. Die Messungen wurden dreifach in mindestens zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt.

Der Nachweis von Cu+ erfolgte mit der iodometrischen Methode45. Das Cu2+ wurde durch eine Komplexbildung mit Kaliumoxalat maskiert; Anschließend wurde das Cu+ durch Kaliumiodat in Gegenwart von 2 M Salzsäure zu Cu2+ oxidiert, wobei die 1 %ige Stärkelösung als Indikator für das Vorhandensein von Jod diente, das nach Abschluss der Reaktion erscheint.

P-Werte mithilfe des Student-t-Tests, Standardabweichungen und Mittelwerte wurden in Microsoft Excel berechnet.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Villem Aruoja (Nationales Institut für Chemische Physik und Biophysik, Estland) für die englischen Korrekturen des Manuskripts.

EIC Accelerator Grant Nr. 190199469 (NANOWOUND) von der Europäischen Kommission (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). GOVSG16-Stipendium des Estnischen Forschungsrats (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). Arengufond_OB-Stipendium vom Entwicklungsfonds des Nationalen Instituts für Chemische Physik und Biophysik (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). PRG749-Stipendium des Estnischen Forschungsrats (Anne Kahru). Grant COVSG5 von der estnischen Forschungsagentur (Denys Bondar, Yevgen Karpichev). Die Studie wurde teilweise durch das Projekt „Emerging Orders in Quantum and Nanomaterials“ (TK134) des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung unterstützt.

Labor für Umwelttoxikologie, Nationales Institut für Chemische Physik und Biophysik, Akadeemia Tee 23, 12618, Tallinn, Estland

Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Heiki Vija, Anne Kahru und Olesja Bondarenko

Nanordica Medical OÜ, Vana-Lõuna tn 39a-7, 10134, Tallinn, Harjumaa, Estland

Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo und Olesya Bondarenko

Abteilung für Chemie und Biotechnologie, Technische Universität Tallinn, Akadeemia tee 15, 12618, Tallinn, Estland

Grigory Vasiliev, Denys Bondar und Yevgen Karpichev

Estnische Akademie der Wissenschaften, Kohtu 6, 10130, Tallinn, Estland

Mutter Kahru

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Konzeptualisierung, GV, OB; Datenkuration, GV und A.-LK; Formale Analyse, GV; Untersuchung, GV, A.-LK und OB; Methodik, GV, A.-LK, OB, HV und DB; Projektverwaltung, OB, AK, YK; Ressourcen, AK, YK und OB; Validierung, Geburtshilfe; Visualisierung, GV; Schreibentwurf, GV und OB; Rezension des Manuskripts, GV, A.-LK, OB, HV, DB, YK, AK Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Olesja Bondarenko.

A.-LK, GV, OB sind Mitbegründer von Nanoordica Medical und entwickeln antibakterielle Produkte auf Nanopartikelbasis. AK, DB, HV und YK erklären keine konkurrierenden Interessen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Vasiliev, G., Kubo, AL., Vija, H. et al. Synergistische antibakterielle Wirkung von Kupfer- und Silber-Nanopartikeln und ihr Wirkmechanismus. Sci Rep 13, 9202 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

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Eingegangen: 27. Januar 2023

Angenommen: 04. Juni 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

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