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Jun 10, 2023

Gemischter Schwermetallstress löst eine globale Eisenmangelreaktion aus

The ISME Journal Band 17, Seiten 382–392 (2023)Diesen Artikel zitieren 3078 Zugriffe 2 Zitationen 54 Altmetric Metrics Details Mehrfache Schwermetallkontamination ist ein immer häufiger auftretendes globales Problem.

The ISME Journal Band 17, Seiten 382–392 (2023)Diesen Artikel zitieren

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54 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die mehrfache Schwermetallbelastung ist ein immer häufiger auftretendes globales Problem. Schwermetalle können den mikrobiell vermittelten biogeochemischen Kreislauf stören. Es fehlen jedoch Studien auf Systemebene zu den Auswirkungen von Schwermetallkombinationen auf Bakterien. Für diese Studie haben wir uns auf den Untergrund des Oak Ridge Reservats (ORR; Oak Ridge, TN, USA) konzentriert, der mit mehreren Schwermetallen und hohen Nitratkonzentrationen kontaminiert ist. Unter Verwendung eines nativen Bacillus cereus-Isolats, das eine dominante Art an diesem Standort darstellt, haben wir die kombinierte Wirkung von acht Metallverunreinigungen, alle in standortrelevanten Konzentrationen, auf Zellprozesse mithilfe eines integrierten Multi-Omics-Ansatzes bewertet, der Entdeckungsproteomik, gezielte Metabolomik, und gezielte Genexpressionsprofilierung. Die Kombination von acht Metallen beeinflusste die Zellphysiologie in einer Weise, die aus der Summierung der phänotypischen Reaktionen auf die einzelnen Metalle nicht hätte vorhergesagt werden können. Die Exposition gegenüber der Metallmischung löste eine globale Eisenmangelreaktion aus, die bei einzelnen Metallexpositionen nicht beobachtet wurde. Diese Störung der Eisenhomöostase führte zu einer verringerten Aktivität der Eisen-Cofaktor-haltigen Nitrat- und Nitritreduktasen, die beide für die biologische Nitratentfernung am Standort wichtig sind. Wir schlagen vor, dass die kombinatorischen Auswirkungen der gleichzeitigen Exposition gegenüber mehreren Schwermetallen eine unterschätzte, aber bedeutende Form von Zellstress in der Umwelt darstellen, die das Potenzial hat, globale Nährstoffkreisläufe zu stören und biologische Sanierungsbemühungen an Mischabfalldeponien zu behindern. Unsere Arbeit unterstreicht die Notwendigkeit, von Einzelmetallstudien zu Multimetallstudien überzugehen, um die Auswirkungen komplexer Kontaminanten auf mikrobielle Systeme zu bewerten und vorherzusagen.

Ab dem 20. Jahrhundert kam es sowohl in aquatischen [1, 2] als auch terrestrischen [3, 4] Umgebungen zu einer zunehmenden Schwermetallbelastung aufgrund größerer anthropogener Einträge durch Urbanisierung, industrielle Prozesse und landwirtschaftliche Aktivitäten. Unabhängig von der spezifischen Eintragsquelle ist das gleichzeitige Vorhandensein mehrerer Schwermetalle in erhöhten Konzentrationen ein häufiges Problem an kontaminierten Standorten [2, 5, 6, 7, 8]. Eine aktuelle Metaanalyse von Zhou et al. [2] haben Schwermetallkonzentrationen für globale Oberflächengewässer zusammengestellt und diese Werte mit den Grenzwerten der WHO und der US-EPA verglichen. Von 1972 bis 2017 verlagerte sich die Schwermetallbelastung in Oberflächengewässern von einzelnen Metallen hin zu mehreren Metallen.

Die Verschmutzung durch Schwermetalle ist nicht nur schädlich für die Gesundheit von Menschen [9], Tieren [10, 11] und Pflanzen [12], sondern stört auch den natürlichen Kreislauf der Elemente durch Auswirkungen auf die mikrobielle Aktivität. Aponte et al. [13] fanden heraus, dass einzelne Schwermetallverunreinigungen die Aktivitäten wichtiger mikrobieller Bodenenzyme linear verringerten, insbesondere derjenigen, die am Kohlenstoff- und Schwefelkreislauf beteiligt sind. In Bodensystemen hemmen einzelne Schwermetallverunreinigungen mehrere Schritte der Denitrifikationswege, was zur Anhäufung toxischer Zwischenprodukte führt, darunter Nitrit und das Treibhausgas Lachgas [14,15,16]. Allerdings gibt es nur wenige Studien, die die Auswirkungen umweltrelevanter Schwermetallkombinationen auf Umweltmikroorganismen untersuchen. Ein einziger Bericht von Dey et al. [17] untersuchten die proteomische Reaktion des eukaryontischen Mikroorganismus Aspergillus fumigatus auf Multimetallstress und schlugen eine Rolle von Proteinumsatzwegen und antioxidativen Proteinen bei dieser Reaktion vor. In dieser Studie wurde jedoch nicht untersucht, ob diese Reaktion auf synergistische oder additive Wechselwirkungseffekte der Metalle in der Mischung zurückzuführen ist. In prokaryotischen Systemen konzentrierten sich die begrenzten Studien zu dieser Stressform ausschließlich auf die Bestimmung der IC50-Werte für binäre Metallkombinationen [18,19,20,21,22,23,24]. Beispielsweise haben Fulladosa et al. [18] untersuchten die synergistische/antagonistische Toxizität binärer Metallpaarungen in Vibrio fisheri, indem sie IC50-Werte für einzelne Metalle und binäre Kombinationen von Metallen bestimmten. Sie fanden heraus, dass Co-Cu- und Zn-Pb-Paare sowie Co-Cd-, Cd-Zn-, Cd-Pb- und Cu-Pb-Paare synergistische bzw. antagonistische Auswirkungen auf das Wachstum von V. fisheri hatten. [18]. Der Mechanismus dieser interaktiven Effekte bleibt jedoch unbekannt, und die Auswirkungen einer mehrfachen Metallexposition auf die Genregulation und den Stoffwechsel von Bakterien sind noch unerforscht.

Der Untergrund des Oak Ridge Reservats (ORR) des US-Energieministeriums (DOE) in Oak Ridge, Tennessee, ist mit Salpetersäure und mehreren Schwermetallen kontaminiert, was ihn ideal für die Untersuchung der Auswirkungen einer Multimetallkontamination auf einheimische mikrobielle Gemeinschaften macht [25]. ]. Die Kontamination an diesem Standort ist das Ergebnis der Einleitung flüssiger Abfälle aus Uranverarbeitungsbetrieben im Y-12 National Security Complex in nicht ausgekleidete Abfallteiche (sogenannte S-3-Teiche) von 1951 bis 1983 [26]. Der Untergrund der Region unmittelbar neben den ehemaligen S-3-Teichen (Abb. 1a) ist mit hohen Mengen an Uran (U) und Nitrat (Abb. 1b, c) sowie erhöhten Konzentrationen anderer Metalle kontaminiert, wie z Nickel (Ni), Cadmium (Cd), Kupfer (Cu), Aluminium (Al), Mangan (Mn) und Eisen (Fe) (Abb. S1) [26, 27]. Da Nitrat ein wichtiger Co-Kontaminant ist, geben die Auswirkungen dieser Metallverunreinigungen auf den Stickstoffkreislauf durch Mikroorganismen am Standort Anlass zu großer Sorge [28, 29]. Zuvor haben wir den Bacillus cereus-Stamm CPT56D-587-MTF (als Stamm CPTF bezeichnet) aus den unterirdischen Sedimenten des Gebiets isoliert, das unmittelbar an die ehemaligen S-3-Teiche angrenzt und als Gebiet 3 bezeichnet wird (Abb. 1a). Der Stamm CPTF führt über NarGHI und NasDE eine dissimilatorische Nitratreduktion zu Ammonium (DNRA) durch (30) und ist ein repräsentatives Isolat einer sehr häufig vorkommenden Amplikonsequenzvariante (ASV), die in den unterirdischen Sedimenten von Gebiet 3 vorkommt. In einer aktuellen Studie wurde dieser CPTF -passendes ASV hatte die höchste relative Häufigkeit in allen Area-3-Proben, bis zu 10–40 % der Gesamtwerte in mehreren Proben, was darauf hindeutet, dass der Stamm CPTF eine dominierende Art in dieser Region darstellt [30]. Somit ist dieses Isolat ideal für detaillierte Studien physiologischer Reaktionen auf ortsrelevante Stressfaktoren.

eine Karte, die den Standort des ORR in den Vereinigten Staaten (USA) zeigt. Die US-Karte wurde mit der Funktion get_stamenmap im in RStudio implementierten ggmap R-Paket generiert [88]. Der Karteneinschub zeigt das Untersuchungsgebiet: die unterirdischen Regionen unmittelbar neben den ehemaligen S-3-Teichen (angezeigt durch ein gelbes, gestricheltes Kästchen). Bereich 3 ist mit einem roten, gestrichelten Kästchen markiert. Die in Goff et al. beschriebene CPTF-Isolierungsstelle. (2022) ist ebenfalls markiert. Verteilung von (b) Nitrat (mM) und (c) Uran (µM) im Grundwasser von Gebiet 3 und in Grundwasserproben, die an zwei Standorten in unmittelbarer Nähe von Gebiet 3 und den ehemaligen S-3-Teichen entnommen wurden. Alle Satellitenkarten wurden in Google My Maps erstellt. Bildmaterial: ©2022 Maxar Technologies. Kartendaten: ©2022 US Geological Survey.

Wir haben den Einfluss einer Mischung aus acht Hauptmetallverunreinigungen des ORR-Untergrunds (Al, U, Mn, Fe, Cd, Cu, Co und Ni) auf den B. cereus-Stamm CPTF untersucht. Wir haben das Wachstum des CPTF-Stammes in Gegenwart einzelner Metalle mit dem Wachstum verglichen, wenn Metalle in Kombination hinzugefügt werden. Mithilfe eines auf Hochdurchsatz-Massenspektrometrie (MS) basierenden Proteomik-Ansatzes verglichen wir die Reaktionen auf Systemebene von Zellen, die der Metallmischung ausgesetzt waren, mit denen von Zellen, die einzelnen Metallen ausgesetzt waren. Wir haben diese Ergebnisse mit einer Kombination aus gezielter MS-basierter Metabolomik und gezielter Genexpressionsprofilierung weiter validiert und erweitert. Um schließlich die möglichen Auswirkungen auf den Stickstoffkreislauf bei ORR zu untersuchen, untersuchten wir die Auswirkungen der Metallmischung auf die Nitrat- und Nitritreduktion durch den Stamm CPTF.

Bacillus cereus str. CPT56D-587-MTF (als Stamm CPTF bezeichnet) [30, 31] wurde routinemäßig auf LB-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C gezüchtet. Eine einzelne isolierte Kolonie wurde in LB-Brühe geimpft und über Nacht unter Schütteln bei 200 U/min und 30 °C gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde für weitere Experimente 100-fach in einem anoxisch definierten Medium verdünnt, das mit Nitrat angereichert war (B. cereus-Versuchsmedium oder BCE-Medium genannt) (Hintergrundinformationen). Für die Metallexposition wurde eine kontaminierte ORR-Umweltmetallmischung (COMM) [32] verwendet, die Folgendes enthält: 500 µM AlK(SO4)2·12H2O, 50 µM UO2(CH3COO)2, 50 µM MnCl2·4H2O, 50 µM NiSO4·6H2O , 15 µM CoCl2·6 H2O, 5 µM (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O, 5 µM CuCl2·2H2O und 2,5 µM Cd(CH3COO)2·2H2O. Für die einzelnen Metallbehandlungen wurden die gleichen Metallsalze und Konzentrationen verwendet.

Der Stamm CPTF wurde in 10 ml BCE-Medium, angereichert mit COMM oder den oben beschriebenen einzelnen Metallkonzentrationen, gezüchtet. Das Wachstum wurde durch Messungen der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) auf einem Spektrophotometer bestimmt.

Der Stamm CPTF wurde in dreifacher 50-ml-Kultur in anoxischem BCE-Medium, angereichert mit COMM oder den oben beschriebenen individuellen Metallkonzentrationen, gezüchtet. Kontrollkulturen hatten keine Änderungen. Nach 10-stündigem Wachstum bei 30 °C wurden Proben für die Proteomanalyse gesammelt. Protein wurde extrahiert und tryptische Peptide wurden unter Befolgung etablierter proteomischer Probenvorbereitungsverfahren hergestellt. Die Peptide wurden mit einem Agilent 1290 UHPLC-System (Santa Clara, CA) analysiert, das an ein Thermo Scientific Obitrap Exploris 480-Massenspektrometer (Waltham, MA) gekoppelt war [33]. Zur Peptididentifizierung und -quantifizierung wurde die Software-Suite DIA-NN (Data-Independent Acquisition with Neural Networks) verwendet (Hintergrundinformationen) [34]. Kurz gesagt wurden 20 µg Trypsin-verdaute Peptide auf eine bei 60 °C betriebene Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18-Säule (2,1 mm ID, 100 mm Länge, 1,9 µm Partikelgröße, 120 Å Porengröße) injiziert. Die Peptide wurden von der Säule unter Verwendung eines 10-minütigen Gradienten von 98 % Puffer A (99,9 % H2O, 0,1 % Ameisensäure) und 2 % Puffer B (99,9 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) bis zu 65 % Puffer A und 35 eluiert % Puffer B. Das Massenspektrometer wird im datenunabhängigen Modus mit einem Arbeitszyklus von 3 MS1-Übersichtsscans und 45 MS2-Scans betrieben. Zur Datenanalyse wurden die Rohdaten analysiert, indem mit einer FASTA-Sequenzdatenbank (bibliotheksfreier Modus) gesucht wurde, die die Proteine ​​aus dem interessierenden Genom (31, 35) und häufige proteomische Kontaminanten enthielt. DIA-NN generiert automatisch einen Satz Täuschungsvorläufer aus der Sequenzdatenbank für Negativkontrollen und nutzt anschließend tiefe neuronale Netze, um Q-Werte zur Unterscheidung zwischen Ziel- und Täuschungsvorläufern zu erhalten [34]. Es gibt die integrierte ionenchromatographische Peakfläche der identifizierten Vorläufer als quantitative Peptidhäufigkeitswerte an. Kürzlich wurde DIA-NN mit fünf anderen DIA-Workflows (Spectronaut, Skyline, DIA-Umpire, ScaffoldDIA) an komplexen Proben verglichen [36]. Quantitative Matrizen auf Proteinebene wurden aus den wichtigsten DIA-NN-Berichten extrahiert und durch ein automatisiertes Python-Skript verarbeitet, das in einem etablierten Protokoll beschrieben ist [37]. Zur quantitativen Analyse wurden die Peptidhäufigkeitswerte zu einer Proteinhäufigkeit summiert. Als nächstes wurden die Proteinhäufigkeiten der Probenreplikate gemittelt und die Standardabweichung und der prozentuale Variationskoeffizient berechnet. Die Imputation fehlender Werte wurde erreicht, indem fehlende Werte durch einen quantitativen Wert von 1000 ersetzt wurden, ein Wert von ~90 % des niedrigsten Werts im Datensatz (LLOD). Für eine vergleichende Analyse wurden angepasste p-Werte mithilfe des Welch-t-Tests mit Benjamini-Hochberg-Anpassung berechnet und angepasste p-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Quantitative MS-basierte Metabolomik wurde verwendet, um proteomische Beobachtungen unterschiedlich regulierter Stoffwechselwege zu validieren. Der Stamm CPTF wurde in 200 ml BCE-Medium (n = 5 Replikate), angereichert mit COMM, gezüchtet. Kontrollkulturen hatten keine weiteren Zusätze zum Medium. Nach 10-stündigem Wachstum bei 30 °C wurden den Zellen Proben zur Analyse entnommen. Intrazelluläre Metaboliten wurden mit einem Agilent 6495 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer mit einer Jetstream-Quelle, gekoppelt an einen Agilent 1290 UPLC-Stack (Hintergrundinformationen), quantifiziert. Die MS-Übergangszustände der Zielverbindungen sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die Daten wurden mit der Agilent Quantitative-Software verarbeitet. Die Quantifizierungsgrenzen sind in Tabelle S2 angegeben.

Der Stamm CPTF wurde dreifach in 500 ml BCE-Medium gezüchtet. Kontrollkulturen hatten keine weiteren Zusätze zum Medium. Ein zweiter Satz Kontrollkulturen wurde mit 5 µM (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O ergänzt – der gleichen Menge Eisen (Fe), die im COMM vorhanden ist. Mit COMM behandelte Kulturen wurden wie oben beschrieben mit Metallen ergänzt. Vor der Inokulation wurde aus jeder Kulturflasche eine Mediumprobe entnommen, um die anfänglichen Fe-Konzentrationen zu bestimmen. Anschließend wurden die Kulturen 10 Stunden lang bei 30 °C gezüchtet und Proben zur Analyse entnommen. Die induktiv gekoppelte Plasma-/Massenspektroskopieanalyse wurde mit einem Agilent 7900 Einzel-Vierfach-Massenspektrometer durchgeführt, um den Gesamteisengehalt des nicht beimpften Kulturmediums, des verbrauchten Mediums und der Ganzzellextrakte zu quantifizieren (Hintergrundinformationen).

Für Nitrat- und Nitrit-Reduktase-Aktivitätstests wurde der Stamm CPTF in 500 ml BCE-Medium mit oder ohne COMM-Zusatz bei 30 °C gezüchtet. Nach 10-stündigem Wachstum wurden die Zellen durch 15-minütige Zentrifugation bei 6600 × g und 4 ° C geerntet. Die Zellen wurden einmal in vorgekühltem 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Nitrat- und Nitrit-Reduktase-Assays wurden unter Verwendung einer modifizierten Version des von Thorgersen und Adams [38] (Hintergrundinformationen) beschriebenen Verfahrens durchgeführt.

Der Stamm CPTF wurde in dreifacher 50-ml-Kultur in BCE-Medium gezüchtet. Als Kontrolle wurde ein Satz Kulturen unbehandelt gelassen. Ein Satz wurde mit dem oben beschriebenen COMM behandelt. Nach 10-stündigem Wachstum bei 30 °C wurde die RNA extrahiert und die cDNA hergestellt (Hintergrundinformationen). Die quantitative qRT-PCR wurde mit dem Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent) durchgeführt. Primer wurden entwickelt, um das Produkt mit ca. 150 bp innerhalb der Zielgene zu amplifizieren (Tabelle S3). Als Referenzgen wurde das recA-Gen (UIJ64731.1) verwendet. Statistische Vergleiche wurden mithilfe eines Student-t-Tests durchgeführt.

Im kontaminierten ORR-Untergrund kommen mehrere Metalle in erhöhten Konzentrationen zusammen mit hohen Nitratwerten vor [26]. Um die Toxizität dieser Metalle zu untersuchen, setzten wir das ORR-Isolat B. cereus-Stamm CPTF einer kontaminierten ORR-Umweltmetallmischung (COMM) aus, die acht Metalle enthielt: Al3+ (500 µM), U6+ (50 µM), Mn2+ (50 µM), Fe2+ (5 µM), Cd2+ (2,5 µM), Co2+ (15 µM), Cu2+ (5 µM) und Ni2+ (50 µM), wobei die Konzentrationen denen entsprechen, die typischerweise in kontaminiertem ORR-Grundwasser vorkommen (Abb. 1, Abb. S1, Tabelle S4). Wachstumsexperimente wurden unter anoxischen, Nitrat atmenden Bedingungen durchgeführt. Im Vergleich zur Kontrolle wiesen mit COMM gezüchtete CPTF-Stammkulturen eine langsamere Wachstumsrate und eine geringere Wachstumsausbeute auf (Abb. 2a). Um festzustellen, ob die einzelnen Metalle auch das Wachstum hemmen, wurden die Zellen mit den einzelnen COMM-Komponenten in ihren COMM-Konzentrationen gezüchtet. Für alle oben genannten metallexponierten Kulturen haben wir das Wachstum am Übergangspunkt zwischen exponentieller und stationärer Phase (10 h) verglichen (Abb. 2b). Es gab keinen signifikanten Unterschied (p > 0,05) zwischen dem Wachstum der Kontrollkultur und dem Wachstum während Al, U, Mn, Co, Fe oder Cd. Allerdings betrug das Wachstum mit Ni und Cu 87 ± 3,9 % bzw. 92 ± 4,4 % der Kontrolle (p < 0,05). Wir gingen davon aus, dass die Toxizität des COMM das Ergebnis der additiven oder synergistischen Wirkung der leicht toxischen Ni und Cu sein könnte. Der Wachstumsdefekt von CPTF, der mit Ni und Cu in ihren COMM-Konzentrationen gezüchtet wurde, war jedoch nicht so groß wie der, der in Gegenwart von COMM beobachtet wurde (Abb. S2). Diese Daten deuten darauf hin, dass die kombinierte Toxizität der COMM-Metalle größer ist als das, was aus der Summe der einzelnen Teile vorhergesagt werden würde.

Eine Wachstumsbewertung wurde unter anoxischen Nitrat-Atmungsbedingungen mit Glucose (20 mM) als Kohlenstoffquelle durchgeführt. Die zugesetzten Konzentrationen der einzelnen Metalle sind in der Legende angegeben. Das COMM ist eine Mischung aller Metalle in den gleichen Konzentrationen, wie sie einzeln vorhanden sind (Tabelle S4). Jeder Zeitpunkt entspricht einem Durchschnitt von drei Wiederholungen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden Fehlerbalken nicht angezeigt, können aber in Tabelle S5 eingesehen werden. Das gestrichelte Kästchen gibt den 10-Stunden-Zeitpunkt an, an dem Proben für die später im Manuskript beschriebene Proteomanalyse gesammelt wurden. b Wachstum zum Zeitpunkt 10 Stunden. Fehlerbalken stellen ±SD dar. Die Daten sind der Durchschnitt von drei Replikaten.

Wir haben die Wechselwirkungen der COMM-Metalle im Zellsystem des Stammes CPTF mithilfe eines proteomikbasierten Ansatzes weiter untersucht. Wir verglichen die proteomische Reaktion von mit COMM gezüchteten Zellen mit denen von Zellen, die mit den einzelnen Metallbehandlungen gezüchtet wurden. Dreifache CPTF-Kulturen wurden entweder mit dem COMM oder einzelnen Metallen in den gleichen Konzentrationen gezüchtet, in denen sie im COMM vorhanden sind. Den Kontrollkulturen wurden außer denen im Standardmedium keine anderen Metalle zugesetzt. Alle Kulturen wurden unter anoxischen, Nitrat atmenden Bedingungen gezüchtet. Nach 10 Stunden wurden Proben für die MS-basierte Proteomikanalyse gesammelt (Abb. 2). Unter allen zehn Bedingungen wurden insgesamt 1303 einzigartige Proteine ​​identifiziert (Tabelle S6). Unterschiedlich häufig vorkommende Proteine ​​in metallbehandelten Kulturen wurden durch Vergleich mit Kontrollkulturen ohne Metallexposition identifiziert. Insgesamt wurden bei den neun Metallbehandlungen (COMM und acht einzelne Metalle; Abb. 3a, Tabelle S7) 295 unterschiedlich häufig vorkommende Proteine ​​​​identifiziert (p <0, 05). Von diesen 295 Proteinen waren 191 (65 %, als Gruppe 1 bezeichnet) nur in den mit COMM behandelten Kulturen unterschiedlich häufig anzutreffen. Der Rest (35 %, Gruppe 2) war in der COMM und einer oder mehreren einzelnen Metallbehandlungen unterschiedlich häufig oder nur in den einzelnen Metallbehandlungen.

a Netzwerkdiagramme unterschiedlich häufiger Proteine ​​nach 10-stündigem Wachstum unter anoxischen Nitrat-Atmungsbedingungen (n = 3 Replikate). Große Knoten stellen den Metallbehandlungszustand dar. Kleine Knoten stellen einzelne, unterschiedlich häufig vorkommende Proteine ​​dar (im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle). Kanten zeigen Bedingungen an, unter denen die Proteine ​​unterschiedlich häufig vorkommen. Netzwerkkarten zeigen Proteine, deren Häufigkeit als Reaktion auf Metallbehandlungen zunahm (i) oder (ii) abnahm. Kleine Knoten-/Kantenfarben (die Legende ist im Bild dargestellt) stellen die Anzahl der Behandlungsgruppen dar, die sich die unterschiedlich häufig vorkommenden Proteine ​​teilen. Hintergrundwolkenfarben unterscheiden die Proteine ​​der Gruppe 1 (grün: nur unterschiedlich häufig in der COMM-Behandlung) von den Proteinen der Gruppe 2 (lila: alle anderen Proteine). b Funktionsvergleiche von Proteinen der Gruppen 1 und 2 anhand der COG-Kategorien. Kategorie S (unbekannte Funktion) wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit aus der Visualisierung ausgeschlossen. Alle anderen Kategorien waren in den unterschiedlich häufig vorkommenden Proteomen nicht vertreten.

Insgesamt 276 der 295 unterschiedlich häufig vorkommenden Proteine ​​wurden den COG-Kategorien (Cluster of Orthologous Genes) zugeordnet (39) (Abb. 3b). Ein Funktionsvergleich der Proteine ​​der Gruppe 1 mit denen der Gruppe 2 ergab eine etwa 2,5-fache Anreicherung der COG-Kategorie E (Aminosäurestoffwechsel und -transport) unter den Proteinen der Gruppe 1. Eine detailliertere Analyse ergab, dass eine Reihe dieser Proteine ​​der Gruppe 1 der Kategorie E an der Biosynthese der essentiellen Aminosäure Tryptophan beteiligt waren. Darüber hinaus gehörte keines der Proteine ​​der Gruppe 2 zur Kategorie Q (Biosynthese, Transport und Katabolismus von Sekundärmetaboliten). Im Gegensatz dazu fielen zehn (5 %) der Proteine ​​der Gruppe 1 in die COG-Kategorie Q. Dazu gehörten mehrere, die an der Biosynthese des Siderophors Bacillibactin beteiligt waren. Bacillibactin ist ein Siderophor vom Tripeptid-Katecholat-Typ, das von Mitgliedern der Gattung Bacillus zur Chelatisierung von Eisen(III)-Eisen (Fe3+) aus der Umgebung in Zeiten von Eisenmangel abgesondert wird [40]. Diese beiden Beobachtungen sind interessant, da vorhergesagt wird, dass die Tryptophan- und Bacillibactin-Biosynthesewege des Stammes CPTF Chorismite als gemeinsames Zwischenprodukt aufweisen [41, 42]. Chorismat ist der Verzweigungspunkt in der Biosynthese aromatischer Aminosäuren und anderer aromatischer Metaboliten [43].

Eine weitere Analyse spezifischer Proteinhäufigkeitsmuster ergab, dass die Bacillibactin-Biosyntheseenzyme Isochorismatsynthase (DhbC), 2,3-Dihydrozybenzoatdehydrogenase (DhbB) und (2,3-Dihydrozybenzoat)adenylatsynthase (DhbE) nur in COMM-exponierten Kulturen nachgewiesen wurden Behandlung, jedoch nicht in Kontrollkulturen oder einzelnen Metallexpositionskulturen (Abb. 4a). Wo kommerzielle Standards verfügbar waren, führten wir eine gezielte MS-basierte Analyse intrazellulärer Metaboliten durch, um Änderungen im Stoffwechselwegfluss zu bestätigen, die aus den Proteomikdaten hervorgehen. DhbC (ON, unterstellt +6,8 log2FC) katalysiert die Umwandlung von Chorismat in Isochorismat. Wahrscheinlich aufgrund seiner Rolle als Verzweigungspunkt-Zwischenprodukt waren die Konzentrationen von Chorismat in allen Proben niedrig und es wurde kein Unterschied in seinen Konzentrationen zwischen Kontroll- und COMM-Kulturen beobachtet (Abb. 4b). Isochorismat wird dann durch DhbB (ON, unterstellt +9,6 log2FC) in 2,3-Dihydroxy-2,3-dihydroxybenzoat und dann durch ein Enzym, das nicht unterschiedlich häufig vorkam, in 2,3-Dihydroxybenzoat umgewandelt. Wir fanden heraus, dass die intrazellulären 2,3-Dihydroxybenzoat-Spiegel als Reaktion auf die COMM-Exposition um das 8,7-fache anstiegen (Abb. 4b), was wahrscheinlich auf einen größeren Stoffwechselfluss durch den Stoffwechselweg zurückzuführen ist. In Bakterien wie Bacillus subtilis wird 2,3-Dihydroxybenzoat zusätzlich zu seiner Rolle als biosynthetisches Zwischenprodukt als Siderophor sezerniert [44, 45]. Die Adenylierung von 2,3-Dihydrozybenzoat zu (2,3-Dihydrozybenzoat)adenylat wird durch DhbE (ON, unterstellt +6,4 log2FC) katalysiert. Der letzte Schritt ist die Bildung des Tripeptids Bacillibactin, vermittelt durch eine nicht-ribosomale Peptidsynthase, die in unserem Datensatz nicht unterschiedlich häufig vorkommt.

Bei allen Panels weisen Sternchen auf unterstellte log2-fache Änderungen aufgrund der Nichtnachweisbarkeit des Peptids unter den verglichenen Bedingungen hin. Diese Faltungsänderung wurde ausgehend von einem quantitativen Wert von 1000 berechnet, einem Wert von etwa 90 % des niedrigsten Werts im Datensatz (LLOD). a Muster der Proteinhäufigkeit über die Enzyme des Bacillibactin- und Tryptophan-Biosynthesewegs. Wärmekarten zeigen durchschnittliche (n = 3 Replikate) log2-fache Häufigkeitsänderungen einzelner Proteine ​​über die verschiedenen Behandlungsbedingungen im Vergleich zur Kontrolle (von links nach rechts: COMM, U, Al, Mn, Fe, Co, Cu, Cd, Ni). Die Zahlen in Klammern rechts neben den Proteinnamen geben die spezifische log2-fache Veränderung des Proteins in den COMM-exponierten Kulturen an. Der Maßstab der Wärmekarte (angezeigt bei log2-fachen Häufigkeitsänderungen relativ zur Kontrolle) befindet sich am unteren Rand des Bildes. Blaue Kästchen zeigen eine erhöhte Proteinhäufigkeit an (p < 0,05), rote Kästchen zeigen Proteine ​​an, deren Häufigkeit deutlich verringert war (p < 0,05) und weiße Kästchen zeigen keinen signifikanten Unterschied in der Häufigkeit im Vergleich zur Kontrolle an. Pathway-Proteine, denen eine Wärmekarte fehlt, zeigten unter keinen der getesteten Bedingungen eine signifikante Veränderung in den Häufigkeitsmustern. b Diagramme der intrazellulären Konzentrationen ausgewählter Metaboliten des Bacillibactin/Tryptophan-Biosynthesewegs (n = 5 Replikate). Mittellinien stellen Mittelwerte dar. Interquartilbereiche und Maximal-/Minimalwerte werden durch Box-Bereiche bzw. Whisker-Bereiche dargestellt. Mittelwerte werden mit einem „x“ gekennzeichnet. Interne Punkte sind mit Punkten markiert. * p < 0,01, ** p < 0,001. c Unterschiedliche Proteinhäufigkeitsmuster mutmaßlicher Bacillibactin-Transporter. Die Details der Heatmap sind die gleichen wie in (a).

Im Gegensatz zum Bacillibactin-Biosyntheseweg war die Häufigkeit von drei Enzymen im Tryptophan-Biosyntheseweg als Reaktion auf die COMM-Behandlung signifikant verringert (Abb. 4a), obwohl sich ihre Häufigkeit auch bei keiner der einzelnen Metallbehandlungen veränderte. Dazu gehörte die Anthranilat-Synthase (TrpE, −7,3 log2FC), die die Umwandlung von Chorismat in Anthranilat katalysiert. Diese Beobachtung wird dadurch gestützt, dass die intrazellulären Anthranilatkonzentrationen als Reaktion auf die COMM-Exposition um das 2,0-fache abnahmen (Abb. 4b). Anthranilat-Phosphoribosyltransferase (TrpD), die die Umwandlung von Anthranilat in N-(5-Phosphoribosyl)-anthranilat katalysiert, war unter allen Bedingungen nachweisbar, mit Ausnahme der COMM-Exposition (AUS, unterstellte −8,6 log2FC). In ähnlicher Weise war die Tryptophan-Synthase-Beta-Untereinheit unter allen Bedingungen nachweisbar, mit Ausnahme der COMM-Exposition (TrpB, OFF, unterstellte −10,0 log2FC). TrpB katalysiert die Umwandlung des nachgeschalteten Zwischenprodukts Indol in Tryptophan. Im Einklang mit den verringerten TrpB-Spiegeln und dem geringeren Stoffwechselfluss durch den Stoffwechselweg verringerten sich die intrazellulären Tryptophankonzentrationen während der COMM-Exposition um das 1,3-fache (Abb. 4).

Wir haben während der COMM-Exposition auch zwei mutmaßliche Siderophortransporter entdeckt, die unter Kontrollbedingungen nicht nachweisbar waren. Wir stellen jedoch fest, dass diese Transporter Teil der Proteine ​​der Gruppe 2 waren, da sie auch bei einigen einzelnen Metallbehandlungen nachgewiesen wurden (Abb. 4c). Die substratbindende Untereinheit (FeuA, ON, unterstellt +8,8 log2FC) des FeuABC-Transporters vom Bacillibactin-Fe3+-ATP-Typ [46] war während der COMM-Exposition signifikant erhöht. Darüber hinaus gibt es zwar kein Homolog eines charakterisierten Bacillibactin-Exporters [47] im Genom des Stammes CPTF, wir haben jedoch während des Wachstums ein Mitglied eines Di/Tripeptid-Kationen-Symporters vom Typ „Major Facilitator Superfamily“ (MFS) nachgewiesen (ON, unterstellt +10,5 log2FC). mit COMM, das unter Kontrollbedingungen nicht nachweisbar war. Dieser Transporter wurde auch während der Cu- und Ni-Exposition nachgewiesen (Abb. 4c). Der zuvor charakterisierte Bacillibactin-Transporter von B. subtilis (YmfE) ist ebenfalls vom MFS-Typ [47]. Diese vorgeschlagene Funktion wird dadurch weiter unterstützt, dass sich das für diesen Transporter kodierende Gen (LW858_01095) unmittelbar neben einem zweiten Siderophor-Fe3+-Transportsystem vom ABC-Typ befindet (Abb. S3) und einem auf Metall reagierenden Transkriptionsregulator vom ArsR-Typ nachgeschaltet ist [48] .

Unsere proteomischen und metabolomischen Daten deuten darauf hin, dass es während der COMM-Exposition von B. cereus str. zu einer erhöhten Produktion, einem erhöhten Export und Wiederimport von Bacillibactin und/oder 2,3-Dihydrozybenzoat kommt. CPTF. Allerdings sind die Biosynthese und der Membrantransport von Siderophoren energetisch kostspielige Prozesse [49, 50]. Darüber hinaus wird die Eisenaufnahme typischerweise von Bakterienzellen streng reguliert, um eine Fehlmetallisierung von nicht eisenhaltigen Metalloproteinen zu verhindern [51] und oxidative Schäden, die durch übermäßiges intrazelluläres Eisen ausgelöst werden [52]. In B. subtilis str. CU1065 und B. cereus str. 569 werden die Gene, die für Siderophor-Biosyntheseenzyme und -transporter kodieren, durch einen kanonischen Eisenaufnahmeregulator (FUR) reguliert, der sein Regulon unter eisenreichen Bedingungen unterdrückt [53, 54]. In Zeiten von Eisenmangel wird das FUR-Regulon deprimiert. Wir nehmen an, dass COMM-Exposition eine globale Eisenmangelreaktion induziert, die eine erhöhte Siderophor-Biosynthese und eine erhöhte Häufigkeit von Siderophor-Transportern beinhaltet. Darüber hinaus schlagen wir vor, dass Chorismat von der Tryptophan- zur Bacillibactin-Biosynthese umgeleitet wird, um die Siderophor-vermittelte Eisengewinnung zu priorisieren. Wir stellen jedoch fest, dass eine solche Reaktion auf Eisenaufnahme/-mangel in diesem System rätselhaft ist, da die bevorzugte Eisenquelle für Mikroorganismen, Eiseneisen (Fe2+), ein Bestandteil des COMM ist.

Wir untersuchten die Proteomdaten und führten gezielte Genexpressionsanalysen durch, um festzustellen, ob die beobachteten Veränderungen in den Bacillibactin- und Tryptophan-Signalwegen auf eine globalere Eisenmangelreaktion auf COMM-Exposition hinweisen, was auf einen physiologischen Bedarf an Eisenaufnahme hindeutet (Tabelle 1). Für diese Analysen verglichen wir unsere Daten mit früheren Studien zu zellulären Reaktionen auf Eisenmangelzustände. Wir haben das Vorhandensein eines FUR-Homologs im Genom des Stammes CPTF mit 83 % Sequenzidentität (volle Länge) zu B. subtilis FUR bestätigt. In B. subtilis sowie anderen Modellmikroorganismen umfasst diese FUR-regulierte Reaktion: (1) eine erhöhte Expression von Transportern für die Eisenaufnahme (z. B. Siderophor-Fe3+-Transporter) und Eisenfängerproteine, (2) eine erhöhte Siderophor-Biosynthese und (3) eine eisensparende Reaktion, einschließlich einer erhöhten Expression von Flavodoxinen (Flds) [53, 55]. Wir haben oben Beweise für einen erhöhten Eisentransport im Stamm CPTF vorgelegt. Im Zusammenhang mit der Eisenabfangung stellen wir die erhöhte Häufigkeit von zwei Häm-Monooxygenasen (HmoA und HmoB) ausschließlich während der COMM-Exposition fest (Tabelle 1). HmoA und B katalysieren die Öffnung des Häm-Porphyrin-Rings, um freies Fe2+ freizusetzen [56]. Häm-Monooxygenasen werden von Bacillus- und Staphylococcus-Arten in Zeiten von Eisenmangel produziert [57,58,59].

Als Reaktion auf die COMM-Exposition stellten wir eine erhöhte Häufigkeit von Enzymen fest, die an der Bacillibactin-Biosynthese beteiligt sind, was mit dem übereinstimmt, was bei anderen Bacillus-Arten in Zeiten von Eisenmangel beobachtet wurde [53, 54]. Wir schlagen weiterhin vor, dass die parallele Abnahme der Häufigkeit der Enzyme im Tryptophan-Biosyntheseweg dazu dient, das intermediäre Chorismat für die Siderophor-Biosynthese zu erhalten. Zur Unterstützung dieses Modells beobachteten wir ausschließlich während der COMM-Exposition eine verringerte Häufigkeit der Prephenatdehydrogenase (TyrA) (Tabelle 1). TyrA katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Prephenat zu 4-Hydroxyphenylpyruvat im Tyrosin-Biosyntheseweg, der auch Chorismat als Zwischenprodukt nutzt [60]. Wir konnten keinen gemeldeten Fall einer Unterdrückung der Tryptophan- oder Tyrosin-Biosynthese in der globalen Eisenmangelreaktion anderer Bakterienarten finden. Dieses neuartige Ergebnis unterstreicht die Stärke der Entdeckungsproteomik in Verbindung mit detaillierter Signalweganalyse zur Aufdeckung nicht offensichtlicher zellulärer Reaktionen auf Umweltstress. Zukünftige Studien sollten klären, wie diese Reaktion reguliert wird und ob sie auch in anderen Bakteriensystemen auftritt.

Um sich an eisenarme Bedingungen anzupassen, reagieren Bakterien typischerweise eisensparend, indem sie die Synthese reichlich vorhandener, nicht essentieller, eisenhaltiger Enzyme und Enzyme, die an der Eisen-Cofaktor-Biosynthese beteiligt sind, minimieren [61]. Die eisensparende Reaktion von B. subtilis unterliegt der posttranskriptionellen regulatorischen Kontrolle der sRNA FsrA (analog zu RhyB in gramnegativen Bakterien) und drei kleinen, basischen Proteinen (FbpA, FbpB und FbpC) [62]. Zu dieser Reaktion gehört eine verminderte Expression von eisenhaltigen Enzymen des TCA-Zyklus, Cytochrom- und Porphyrin-Biogeneseenzymen, Cystein-Biosyntheseenzymen, eisenhaltigen Enzymen der Isoleucin-Biosynthesewege und eisenhaltiger Glutamatsynthase (62, 63). Während der COMM-Exposition beobachteten wir in ähnlicher Weise eine verringerte Häufigkeit der CPTF-Sulfatadenylyltransferase (CysN) und der Adenylylsulfatkinase (CysC) sowie der Ferredoxin-abhängigen Sulfitreduktase (Sir/CysI) (Tabelle 1). Wir spekulieren, dass die verringerte Häufigkeit der nicht eisenhaltigen Enzyme des Cystein-Biosynthesewegs auf die Rolle von Cystein als Schwefeldonor bei der Eisen-Schwefel-Cluster-Biosynthese zurückzuführen ist [64]. Wir beobachteten auch verringerte Glutamat-Synthase-Spiegel (GltB) während der COMM-Exposition (Tabelle 1). Schließlich stellen wir eine verringerte Häufigkeit der NarH-Untereinheit der respiratorischen Eisen-Schwefel-Cluster-haltigen Nitratreduktase fest. Frühere Studien mit B. subtilis während der Eisenlimitierung wurden unter oxischen Bedingungen durchgeführt, wenn keine respiratorische Nitratreduktase produziert wird. Allerdings wurde bei Escherichia coli während der Eisenlimitierung unter anoxischen Bedingungen ein verringerter Spiegel dieses Enzyms nachgewiesen [65].

Im Zusammenhang mit der Eisensparreaktion wird das Protein Fld in Zeiten von Eisenmangel in allen drei Lebensbereichen hochreguliert [66,67,68]. Flavodoxin ist ein kleines Elektronentransferprotein, das einen Flavinmononukleotid-Cofaktor enthält. Unter eisenarmen Bedingungen erhöhen Organismen die Produktion von Fld, das das Eisen-Schwefel-haltige Ferredoxin als physiologischen Elektronendonor für verschiedene Oxidoreduktase-Reaktionen ersetzen kann [66, 68]. Dementsprechend beobachteten wir eine erhöhte Fld-Produktion im COMM-exponierten Proteom des Stammes CPTF im Vergleich zur Kontrolle (Tabelle 1). Die Fld-Werte wurden durch keine der einzelnen Metallbehandlungen verändert.

Wir verwendeten qRT-PCR, um repräsentative Veränderungen der Proteinhäufigkeit zu validieren, die während der COMM-Exposition beobachtet wurden. Wir haben 11 Transkripte ausgewählt, um die verschiedenen Teile der vorgeschlagenen globalen Eisenmangelreaktion des Stammes CPTF darzustellen. Von diesen 11 Transkripten stimmten sieben (dhbB, dhbC, dhbE, mfs, sir, fld und hmoA) mit den Häufigkeitsmustern ihrer jeweiligen Proteinprodukte während der COMM-Exposition überein (Abb. S4). Allerdings wurden vier Transkripte (feuA, trpB, trpD und trpE) trotz großer Veränderungen in ihrer Proteinprodukthäufigkeit, die unter den gleichen Bedingungen beobachtet wurden, nicht unterschiedlich exprimiert. Die Diskrepanz zwischen den FeuA-Transkriptexpressionsniveaus (ns) und den FeuA-Proteinniveaus (+8,8-log2FC) ist wahrscheinlich das Ergebnis zeitlicher Änderungen der Genexpression während des Übergangs in die stationäre Phase, der zu unserem Probenahmezeitpunkt (10 Stunden) beginnt anschließende Verzögerung bei Veränderungen des Proteinspiegels [69]. Im Gegensatz dazu sanken die TrpBDE-Proteinspiegel während der COMM-Exposition, während die Transkripthäufigkeit unverändert blieb, was auf eine posttranskriptionelle oder posttranslationale Regulation dieses Peptidprodukts schließen lässt. Diese Ergebnisse unterstreichen den Nutzen kombinierter proteomischer und transkriptomischer Ansätze.

Während zuvor bei einzelnen Metallexpositionsexperimenten eine erhöhte Häufigkeit von Proteinen beobachtet wurde, die an der Biosynthese und dem Transport von Siderophoren beteiligt sind (70, 71), gibt es keine Berichte über eine Eisenmangelreaktion in dem hier beobachteten Ausmaß beim Stamm CPTF während der COMM-Exposition. Darüber hinaus wurden in diesen früheren Studien entweder hohe Schwermetallkonzentrationen verwendet, die nicht einmal für kontaminierte Umgebungen relevant sind, oder die Schwermetallexposition wurde unter Eisenmangelbedingungen durchgeführt [72]. Bei B. subtilis beispielsweise induziert die Kupferexposition (500 µM) die Expression von Bacillibactin-Biosyntheseenzymen sowie des Bacillibactin-Fe3+-Transporters. Für die Häm-Monooxygenasen oder Fld wurden jedoch keine Expressionsänderungen beobachtet. Darüber hinaus wurden mehrere eisenhaltige Enzyme während der Kupferexposition tatsächlich hochreguliert, und es gab keine Hinweise auf eine eisensparende Reaktion [73]. Somit scheint die Exposition des Stammes CPTF gegenüber COMM einen physiologischen Zustand des Eisenmangels auszulösen, der eher mit dem durch Eisenchelatoren hervorgerufenen Zustand oder dem, was bei Δfur-Mutantenstämmen beobachtet wird, vergleichbar ist [53].

Die Konzentrationen an löslichem Eisen sind im kontaminierten ORR-Grundwasser ([Fe]AVG = 5,6 µM) im Vergleich zu nicht kontaminiertem ORR-Grundwasser ([Fe]AVG = 0,35 µM) erhöht [29, 32]. In unseren Experimenten betrug der lösliche [Fe] 3,7 bzw. 5,3 µM Fe in den Kontroll- und COMM-geänderten Kulturen. Das COMM-Eisen wird in der Eisenform (Fe2+) zugesetzt. Aufgrund der Unlöslichkeit von Fe3+ bei neutralem pH-Wert spiegelt diese Gesamtkonzentration an löslichem Eisen im Medium [Fe2+] wider. Wir haben jedoch beobachtet, dass die COMM-Exposition einen physiologischen Zustand des Eisenmangels induziert, der bei den einzelnen Metallbehandlungen oder den Kontrollkulturen nicht beobachtet wird. Wir gingen davon aus, dass COMM-Komponenten möglicherweise mit Fe2+ um den Transmembrantransport konkurrieren und so die Fe2+-Aufnahme begrenzen. Im Vergleich zu Kontrollkulturen importierten COMM-exponierte Kulturen jedoch zu viel Eisen mit intrazellulären Gesamteisenkonzentrationen von 22,0 bzw. 151,1 µM (Abb. S5A). Als zusätzliche Kontrolle haben wir CPTF-Kulturen mit 5 µM Eisen (das gleiche wie im COMM) ergänzt und die intrazellulären Eisenkonzentrationen gemessen. Obwohl diese Kulturen etwa 50 % mehr Eisen aufnehmen als die unveränderte Kontrolle (jeweils 33,6 vs. 22,0 µM), liegen diese Werte immer noch unter den Werten, die für die COMM-exponierten Kulturen gemessen wurden. Nach der Inkubation und dem Zellwachstum war [Fe]aq in allen verbrauchten Medienproben verringert, aber immer noch > 1 µM (Tabelle S8).

Einzelne Metalle im COMM können auch die intrazelluläre Eisenhomöostase stören, indem sie Eisen an den Metallbindungsstellen von Enzymen verdrängen. Dieser Prozess wird als Fehlmetallierung bezeichnet und ist ein bekannter Toxizitätsmechanismus für viele Schwermetalle [74]. Wir schlagen vor, dass einzelne Metalle im COMM auf unterschiedliche Stadien des Eisen-Cofaktor-Zusammenbaus und der Insertionsprozesse für verschiedene Enzyme abzielen können. Während der individuellen Metallexposition scheinen die Zellen diesen Stress zu bewältigen, indem sie Proteine ​​für die Eisen-Cofaktor-Reparatur und -Biosynthese hochregulieren, ohne dass es zu Wachstumsdefekten kommt (Abb. 2). Beispielsweise beobachteten wir eine erhöhte Häufigkeit von Eisen-Schwefel-Cluster-Reparatur- und Assemblierungsproteinen (IscA und Ric) sowie von Häm-Biosyntheseproteinen (HemFH), während der Stamm CPTF Cd und Cu ausgesetzt wurde (Abb. S5B). In Kombination scheint diese Stressreaktion jedoch überwältigt zu sein, möglicherweise weil mehrere Metalle auf ein breiteres Spektrum eisenhaltiger Enzyme abzielen, was zu einer erheblichen Störung der intrazellulären Eisenhomöostase führt. Die Spiegel von zwei Häm-Biosyntheseproteinen (HemFH) sind während der COMM-Exposition im Vergleich zur Kontrolle erhöht, während dies bei den Eisen-Schwefel-Cluster-Reparatur-/Assemblierungsproteinen nicht der Fall ist, was darauf hindeutet, dass Eisen unter diesen Bedingungen für die Häm-Biosynthese Vorrang haben könnte. Erhöhte Geschwindigkeiten der Eisen-Cofaktor-Synthese, die erforderlich sind, um die Verdrängung von Eisen durch andere Metalle zu überwinden, könnten zu einer erheblichen Verschiebung des intrazellulären Fe2+-Gleichgewichts führen, was zu einer FUR-De-Repression führt.

Die für unsere Experimente verwendeten Nitrat-Atmungsbedingungen imitieren aufgrund der hohen Konzentrationen an anthropogenem Nitrat den kontaminierten ORR-Untergrund. Allerdings kann der Stickstoffkreislauf am Standort durch Schwermetallkokontaminanten beeinflusst werden. In den Porenwässern kontaminierter ORR-Sedimentkerne wurde eine Nitritakkumulation gemessen, was auf eine Hemmung der Nitritreduktion in situ hindeutet [75]. Der Stamm CPTF führt DNRA über die respiratorische Nitratreduktase NarGHI und die Nitritreduktase NasDE durch [30]. Sowohl NarGHI als auch NasDE enthalten Eisen-Cofaktoren [76, 77]. Daher wollten wir herausfinden, ob die durch COMM induzierte Fehlregulation der Eisenhomöostase im Stamm CPTF die Aktivität dieser beiden Enzyme beeinflusst. Wir fanden heraus, dass die Aktivität der NasDE-Nitritreduktase in COMM-exponierten CPTF-Kulturen im Vergleich zu den Kontrollkulturen (12,11 ± 7,48 Einheiten·OD600−1) nahezu nicht vorhanden war (0,25 ± 0,44 Einheiten·OD600−1) (Abb. 5a). . Allerdings blieben die Spiegel beider Proteinuntereinheiten zwischen Kontroll- und COMM-exponierten Kulturen unverändert (Abb. 5b), was darauf hindeutet, dass der Aktivitätsverlust auf die direkte Hemmung des Enzyms durch die Metalle zurückzuführen ist. Wir schlossen eine direkte Hemmung des Nitritreduktase-Holoenzyms durch allosterische Hemmung oder Verdrängung von Metallzentren aus (Tabelle S9). Stattdessen schlagen wir vor, dass die COMM-Metalle während der Eisen-Cofaktor-Biosynthese falsch eingebaut werden, was zu einer Fehlmetallierung des Nitrit-Reduktase-Apoenzyms führt, was zu einer inaktiven Nitrit-Reduktase führt.

a Aktivität von Nitrat- und Nitritreduktasen mit (rote Balken) oder ohne (graue Balken) COMM. Eine Aktivitätseinheit entspricht 1 nmol Nitrat/reduziertem Nitrat pro Minute. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und Fehlerbalken stellen SD dar. b Unterschiedliche Häufigkeit von NarGHI und NasDE. Die Wärmekarte zeigt durchschnittliche (n = 3 Replikate) log2-fache Häufigkeitsänderungen einzelner Proteine ​​über die verschiedenen Behandlungsbedingungen im Vergleich zur Kontrolle (von links nach rechts: COMM, U, Al, Mn, Fe, Co, Cu, Cd). , und Ni). Der Maßstab der Wärmekarte (angezeigt bei log2-fachen Häufigkeitsänderungen relativ zur Kontrolle) befindet sich am unteren Rand des Bildes. Die Anzahl der Fe-Atome pro Protein wurde aus ihren Homologen von Bacillus subtilis (UP000001570) bestimmt. (c) Relative Veränderungen in der Expression von narG, narH und narI mit (rote Balken) und ohne (graue Balken) COMM-Exposition. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Fehlerbalken stellen ±SD dar. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Wir beobachteten auch eine verminderte Nitratreduktaseaktivität in den COMM-exponierten Kulturen im Vergleich zur Kontrolle (9,38 ± 6,00 vs. 31,57 ± 6,03 Einheiten·OD600−1) (Abb. 5a). Wie oben erwähnt, führte die COMM-Exposition zu verringerten Konzentrationen der NarH-Untereinheit der Nitratreduktase im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 5b), was darauf hindeutet, dass die Abnahme der Aktivität teilweise auf niedrigere Proteinkonzentrationen zurückzuführen ist. Es wurden jedoch keine Veränderungen in der NarG- und NarI-Häufigkeit beobachtet (Abb. 5b). Dieser Unterschied in den relativen Häufigkeitsänderungen zwischen den drei Untereinheiten ist rätselhaft, da alle drei im selben Operon vorhanden sind und gemeinsam reguliert werden sollten. Tatsächlich bestätigte die Genexpressionsanalyse die verminderte Expression von narH sowie narI und narG (Abb. 5c). Diese Diskrepanz zwischen den Faltungsänderungen auf Protein- und Transkriptebene ist wahrscheinlich auf unterschiedliche posttranslationale Kontrollen der drei Proteinprodukte zurückzuführen. Eine verringerte narGHI-Expression ist wahrscheinlich Teil der oben beschriebenen eisensparenden Reaktion. Zu einem späteren Zeitpunkt wären wahrscheinlich alle drei Proteinuntereinheiten in den COMM-exponierten Kulturen im Vergleich zur Kontrolle zurückgegangen. Zum Zeitpunkt der Durchführung aller Messungen waren die NarH-Spiegel jedoch möglicherweise bereits einer posttranslationalen Regulierung unterworfen, möglicherweise durch einen verstärkten proteolytischen Abbau. Eine Fehlmetallisierung von Metall-Cofaktor-Zentren kann zu einer Fehlfaltung führen und Proteine ​​gezielt zur Spaltung durch Proteasen angreifen [78]. NarH enthält eine größere Anzahl an Eisenatomen als NarG oder NarI: NarH enthält vorhergesagte 15 Eisenatome pro Proteinmolekül im Vergleich zu 4 bzw. 2 (Abb. 5b). Wir spekulieren, dass NarH dadurch möglicherweise anfälliger für Fehlmetallierung und anschließenden Umsatz durch Proteasen ist als die anderen Untereinheiten. Wir beobachteten ausschließlich während der COMM-Behandlung eine erhöhte Häufigkeit von zwei CPTF-Proteasen: Clp und Hls. Ähnlich wie bei der Nitritreduktase haben wir die Möglichkeit einer Holoenzymhemmung entweder allosterisch oder durch Verdrängung von Metallzentren durch die COMM-Metalle ausgeschlossen (Tabelle S9). Ein integriertes Modell für die Auswirkungen von COMM auf die Nitrat- und Nitritreduktion ist in Abb. 6 dargestellt. Unsere Daten legen nahe, dass die Hemmung der mikrobiellen Nitrit- und Nitratreduktion, die häufig an mit Schwermetallen kontaminierten Standorten beobachtet wird (15, 79), auf mehreren Regulierungsebenen auftreten kann .

a Beobachtete Veränderungen der Enzymspiegel und -funktionen in COMM-exponierten CPTF-Zellen im Vergleich zur Kontrolle. b Vorgeschlagene Mechanismen für die in (a) beschriebenen Änderungen.

Umweltstressoren selektieren mikrobielle Gemeinschaftsfunktionen, die die Widerstandsfähigkeit innerhalb dieser ökologischen Nische fördern. In Metagenomen, die aus kontaminiertem ORR-Grundwasser stammen, kommt es zu einer erheblichen Anreicherung von Genen, die an der Nitratatmung und der Schwermetalltoleranz beteiligt sind (80, 81). Unsere Daten deuten darauf hin, dass multipler Metallstress selbst in eisenreichen Umgebungen wie dem kontaminierten ORR-Untergrund einen physiologischen Zustand des Eisenmangels induziert. Die Analyse veröffentlichter ORR-Metagenomdaten [80] ergab einen signifikanten Überschuss des hochaffinen Eisentransporter-Gens efeU in einem kontaminierten Grundwassermetagenom im Vergleich zu einem Metagenom aus einer unberührten Hintergrundbohrung. EfeU ist wichtig für die Eisenaufnahme unter eisenarmen Bedingungen [82]. Daher können mikrobielle Gemeinschaften in den kontaminierten ORR-Regionen diesen induzierten Eisenmangelzustand erleben und nach Gemeinschaftsmitgliedern suchen, die in der Lage sind, mit diesem Stress umzugehen. Ebenso wie die ORR sind Standorte, die von industriellen und landwirtschaftlichen Aktivitäten betroffen sind, häufig mit Nitrat und mehreren Schwermetallen kokontaminiert [83,84,85]. Die Untersuchung des Zusammenspiels dieser Co-Kontaminanten ist für die Standortverwaltung und Sanierungsbemühungen von entscheidender Bedeutung. Während eine Nitratreduzierung an solchen Standorten wünschenswert sein kann, kann die Anreicherung von Zwischenprodukten wie Nitrit und Lachgas die bestehenden Probleme verschlimmern [25]. Aufgrund der hohen Toxizität von Nitrit für Mikroorganismen selbst bei niedrigen millimolaren Konzentrationen kann Nitrit beispielsweise biologische Sanierungsprozesse hemmen. Darüber hinaus kann die Nitritakkumulation an urankontaminierten Standorten wie dem ORR zur oxidativen Remobilisierung von Uraninit zu UO22+ führen, was den Bemühungen zur biologischen Sanierung entgegenwirkt. Die Hemmung der enzymatischen Aktivität aufgrund der mehrfachen metallinduzierten Störung der Eisenhomöostase könnte zur Akkumulation dieser unerwünschten Zwischenprodukte führen.

Unsere Ergebnisse stellen die Übertragbarkeit von Studien zur Toxizität einzelner Metalle auf kontaminierte Umgebungen in Frage. In diesen Umgebungen existieren Metalle selten als einzelne Einheiten. Dennoch behandeln Studien, die versuchen, mithilfe von Laborexperimenten die biologische Aktivität in diesen Umgebungen einzuschränken, typischerweise gleichzeitig vorhandene Metallverunreinigungen als unabhängige Parameter [86], wobei deren voneinander abhängigen kombinatorischen Wirkungen nur minimal berücksichtigt werden. Die Konstruktion biologischer Regulations- und Stoffwechselmodelle für kontaminierte Umgebungen kann eine begrenzte Vorhersagekraft haben, wenn sie ausschließlich aus Experimenten zur Störung einzelner Metalle abgeleitet wird. Während Einzelmetallexpositionsstudien maßgeblich zur Entwicklung eines detaillierten mechanistischen Verständnisses der Schwermetalltoxizität in mikrobiellen Systemen beigetragen haben, schlagen wir vor, dass es an der Zeit ist, auf Multimetallstörungsstudien umzusteigen, um die Stressoren, denen Mikroorganismen in anthropogen gestörten Umgebungen ausgesetzt sind, besser widerzuspiegeln.

Die generierten Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das Partner-Repository PRIDE [87] mit der Datensatzkennung PXD035730 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. DIA-NN kann kostenlos unter https://github.com/vdemichev/DiaNN heruntergeladen werden.

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Wir danken Lauren Lui und Torben Nielsen (Lawrence Berkeley National Lab) für die erste Unterstützung bei der Suche nach den zuvor veröffentlichten Metagenomdaten. JLG dankt außerdem Nathan Yee (Rutgers) für die lebhaften Diskussionen zum Thema Metallbeständigkeit im Labor im Vergleich zum Feld, das diese Arbeit inspiriert hat. Dieses Material von ENIGMA (Ecosystems and Networks Integrated with Genes and Molecular Assemblies) (http://enigma.lbl.gov), einem Science Focus Area Program am Lawrence Berkeley National Laboratory, basiert auf Arbeiten, die vom US-Energieministerium unterstützt werden. Office of Science, Office of Biological and Environmental Research, unter Vertrag DE-AC02-05CH11231.

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, University of Georgia, Athens, GA, USA

Jennifer L. Goff, Michael P. Thorgersen, Farris L. Poole II, Elizabeth G. Szink und Michael WW Adams

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JLG und MWWA haben die Studie konzipiert. JLG, YC, MPT, LTH, FLP, EGS und CJP führten die Forschung durch und analysierten die Daten. MWWA, CJP und GS überwachten die Forschung und akquirierten Fördermittel. JLG hat den Artikel mit Beiträgen der Co-Autoren verfasst. Alle Autoren haben zur Durchsicht und Bearbeitung des Artikels beigetragen.

Korrespondenz mit Michael WW Adams.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Goff, JL, Chen, Y., Thorgersen, MP et al. Gemischter Schwermetallstress löst eine globale Eisenmangelreaktion aus. ISME J 17, 382–392 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-022-01351-3

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Eingegangen: 05. August 2022

Überarbeitet: 08. Dezember 2022

Angenommen: 13. Dezember 2022

Veröffentlicht: 26. Dezember 2022

Ausgabedatum: März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01351-3

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